Optical Tweezers for Single Molecule Biology

Molecular machinery on the micro-scale, believed to be the fundamental building blocks of life, involve forces of 1-100 pN and movements of nanometers to micrometers. Micromechanical single-molecule experiments seek to understand the physics of nucleic acids, molecular motors, and other biological systems through direct measurement of forces and displacements. Optical tweezers are a popular choice among several complementary techniques for sensitive force-spectroscopy in the field of single molecule biology. The main objective of this thesis was to design and construct an optical tweezers instrument capable of investigating the physics of molecular motors and mechanisms of protein/nucleic-acid interactions on the single-molecule level. A double-trap optical tweezers instrument incorporating acousto-optic trap-steering, two independent detection channels, and a real-time digital controller was built. A numerical simulation and a theoretical study was performed to assess the signal-to-noise ratio in a constant-force molecular motor stepping experiment. Real-time feedback control of optical tweezers was explored in three studies. Position-clamping was implemented and compared to theoretical models using both proportional and predictive control. A force-clamp was implemented and tested with a DNA-tether in presence of the enzyme lambda exonuclease. The results of the study indicate that the presented models describing signal-to-noise ratio in constant-force experiments and feedback control experiments in optical tweezers agree well with experimental data. The effective trap stiffness can be increased by an order of magnitude using the presented position-clamping method. The force-clamp can be used for constant-force experiments, and the results from a proof-of-principle experiment, in which the enzyme lambda exonuclease converts double-stranded DNA to single-stranded DNA, agree with previous research. The main objective of the thesis was thus achieved. The developed instrument and presented results on feedback control serve as a stepping stone for future contributions to the growing field of single molecule biology.

Molekylära biologiska mekanismer involverar 0-100 pN krafter och rörelser från under en nanometer till flera mikrometer. Mikromekaniska experiment strävar till att förklara hur dessa mekanismer/maskiner fungerar genom direkt mätning av rörelser och krafter. Bland flera komplementära enmolekyls-tekniker är den optiska pincetten populär pga. dess höga platsresolution och lämpliga styvhet. En optisk pincett använder laserljus för att ta tag i och mäta krafter/rörelser hos dielektriska partiklar. I enmolekyls experiment binds biomolekyler kemiskt till plastbollar som hålls i pincetten och fungerar som 'handtag' till mikro-världen. Huvudmålet med denna avhandling var att utveckla och bygga ett laserpincett instrument som möjliggör enmolekyls experiment som förklarar molekylära mekanismer samt biofysiken i protein/nukleinsyra-växelverkningar. Ett laserpincett instrument med två pincetter, den ena styrbar, position/kraft mätning i båda pincetterna med hög resolution, samt en realtids kontroller byggdes. Avhandlingen består av fyra artiklar och ett sammandrag. Den första artikeln analyserar signal/brusförhållandet (SNR) i ett enmolekyls experiment. I mikro-skala påverkas det biologiska system som undersöks samt plastbollarna av värmerörelse, vilket försämrar SNR. Artikeln visar vilka förhållanden (molekylens längd, styvhet, spänning, osv.) leder till hög SNR och experiment som kan observera enskilda steg hos molekylära maskiner (steglängden varierar från 0,34 nm för t.ex. DNA-polymeras, till 36 nm för t.ex. myosin). I den andra och tredje artikeln användes realtids-kontrollern för att fixera en plastboll i pincetten, värmerörelsen till trots. Pincetten styrdes 200 000 gånger per sekund på basen av bollens mätta position. Pincettens effektiva styvhet kunde ökas ca. 10-faldigt. I den fjärde artikeln användes kontrollern för att upprätthålla en konstant 3.4 pN spänning i en DNA-molekyl. Molekylen fördes till en lösning innehållande enzymet lambda exonukleas som konverterar dubbel-strängat DNA till en-strängat. Vid 3.4 pN spänning är en-strängat DNA signifikant kortare än dubbel-strängat, och molekylens krympande från ~14 μm till ~8 μm längd observerades under ca 20 min. Detta experiment visar att huvudmålet för avhandlingen uppnåddes. Det utvecklade instrumentet lämpar sig för enmolekylsexperiment och kan användas för framtida kontributioner inom enmolekyls biofysik.