Bacteria colonizing paper machines

Bacteria growing in paper machines can cause several problems. Biofilms detaching from paper machine surfaces may lead to holes and spots in the end product or even break the paper web leading to expensive delays in production. Heat stable endospores will remain viable through the drying section of paper machine, increasing the microbial contamination of paper and board. Of the bacterial species regularly found in the end products, Bacillus cereus is the only one classified as a pathogen. Certain B. cereus strains produce cereulide, the toxin that causes vomiting disease in food poisonings connected to B. cereus. The first aim of this thesis was to identify harmful bacterial species colonizing paper machines and to assess the role of bacteria in the formation of end product defects. We developed quantitative PCR methods for detecting Meiothermus spp. and Pseudoxanthomonas taiwanensis. Using these methods I showed that Meiothermus spp. and Psx. taiwanensis are major biofoulers in paper machines. I was the first to be able to show the connection between end product defects and biofilms in the wet-end of paper machines. I isolated 48 strains of primary-biofilm forming bacteria from paper machines. Based on one of them, strain K4.1T, I described a novel bacterial genus Deinobacterium with Deinobacterium chartae as the type species. I measured the transfer of Bacillus cereus spores from packaging paper into food. To do this, we constructed a green fluorescent protein (GFP) labelled derivative of Bacillus thuringiensis and prepared paper containing spores of this strain. Chocolate and rice were the recipient foods when transfer of the labelled spores from the packaging paper to food was examined. I showed that only minority of the Bacillus cereus spores transferred into food from packaging paper and that this amount is very low compared to the amount of B. cereus naturally occurring in foods. Thus the microbiological risk caused by packaging papers is very low. Until now, the biological function of cereulide for the producer cell has remained unknown. I showed that B. cereus can use cereulide to take up K+ from environment where K+ is scarce: cereulide binds K+ ions outside the cell with high affinity and transports these ions across cell membrane into the cytoplasm. Externally added cereulide increased the growth rate of cereulide producing strains in medium where potassium was growth limiting. In addition, cereulide producing strains outcompeted cereulide non-producing B. cereus in potassium deficient environment, but not when the potassium concentration was high. I also showed that cereulide enhances biofilm formation of B. cereus.

Paperitehtailla kasvavat bakteerit aiheuttavat monia ongelmia. Paperikoneen teräspinnoilta irtoavat biofilmipalat voivat näkyä reikinä ja läikkinä lopputuotteessa, tai jopa katkaista paperirainan johtaen kalliiseen tuotannon keskeytykseen. Kuumuutta kestävät bakteeri-itiöt säilyvät elävinä paperikoneen kuivausosan läpi heikentäen paperin tai kartongin hygieenistä laatua. Paperista yleisesti löydettävistä bakteerilajeista Bacillus cereus on ainoa, joka luokitellaan ihmiselle patogeeniseksi. Jotkin B. cereus kannat tuottavat kereulidia, toksiiinia joka voi aiheuttaa ihmisille jopa kuolemaan johtavan ruokamyrkytyksen. Väitöskirjatyöni ensimmäinen tavoite oli tunnistaa paperikoneilla kasvavia haitallisia bakteerilajeja ja selvittää niiden osuus paperin likaläikkien syntyyn. Kehitimme kvantitatiiviset PCR menetelmät Meiothermus-bakteerisuvun ja Pseudoxanthomonas taiwanensis bakteerilajin tutkimiseen. Näillä menetelmillä osoitin, että Meiothermus- ja Pseudoxantomonas -bakteerit ovat yleisiä paperitehtaiden biofilmeissä ja kiertovesissä. Osoitin myös yhteyden paperikoneen märkäpään biofilmien ja lopputuotteiden likäläikkien välillä: molemmista löytyi suuria määriä samojen bakteerilajien DNA:ta. Väitöskirjatyöni aikana eristin paperitehtailta 48 sellaista bakteerikantaa, jotka pystyvät tarttumaan puhtaalle pinnalle ja kasvamaan biofilminä paperitehdasolosuhteissa. Yksi niistä, kanta K4.1T, edustaa tieteelle aiemmin tuntematonta bakteerisukua. Tämän kannan perusteella kuvasin uuden bakteerisuvun ja lajin, Deinobacterium chartae. Työni toinen tavoite oli selvittää elitarvikepakkauskartongista ruokaan siirtyvien Bacillus cereus itiöiden määrä. Käytin tähän kehittämäämme fluoresoivalla proteiinilla (GFP) leimattua bakteerikantaa. Valmistimme kartonkia, joka sisälsi leimattuja bakteeri-itiöitä ja tutkimme kuinka suuri osa itiöistä siirtyy kartongista suklaaseen ja riisiin. Osoitin, että ruokaan siirtyneiden itiöiden osuus oli hyvin pieni. Ruuissa on luontaisesti B. cereus bakteereja, ja niiden määrä on usein paljon suurempi kuin kokeessamme ruokaan siirtyneiden itiöiden määrä. Täten pakkauskartonkien aiheuttama mikrobiologinen riski ruuan turvallisuudelle on pieni. Selvitin myös mitä hyötyä kereulidia tuottava bakteeri saa itselleen tästä ihmiselle erittäin myrkyllisestä molekyylistä. Osoitin, että B. cereus pystyy hyödyntämään ympäristön kaliumvarantoja paremmin kereulidin avulla. Lisätty kereulidi nopeutti kereulidia tuottavien B. cereus -kantojen kasvua ympäristössä, jossa kaliumia oli niukasti tarjolla. Lisäksi osoitin, että kereulidi lisää Bacillus cereus -kantojen kasvua biofilmeinä.