Identification of molecules relevant for the invasiveness of fibrosarcomas and melanomas

Cancer is becoming the leading cause of deaths in the world. As 90% of all deaths from cancer are caused by metastasis, discovery of the mechanisms behind cancer cell invasion and metastasis is of utmost importance. Only new effective therapies targeting cancer progression can reduce cancer mortality rates. The aim of this study was to identify molecules that are relevant for tumor cell invasion and spreading in fibrosarcomas and melanomas, and to analyze their potential for cancer biomarkers or therapeutic targets. First, the gene expression changes of normal cells and transformed cells showing high invasiveness, S-adenosylmethionine decarboxylase (AdoMetDC)-transfected murine fibroblasts and human melanoma cells, were studied by microarray analyses. The function of the identified candidate molecules were then studied in detail in these cell lines. Finally, the physiological relevance of the identified changes was studied by immunohistochemical analyses of human sarcoma and melanoma specimens or by a mouse xenograft model. In fibrosarcoma cells, the most remarkable change detected was a dramatic up-regulation of the actin-sequestering molecule thymosin beta 4 (TB4), which was shown to be important for the transformed phenotype of the AdoMetDC-transfected cells (Amdc-s and -as). A sponge toxin latrunculin A, inhibiting the binding of TB4 to actin, was found to selectively inhibit the migration and invasion of these cells. Further, Amdc-s-induced mouse tumors and human high-grade sarcomas were found to show intense TB4 immunostaining. In addition to TB4, integrin subunits alfa 6 and beta 7 (ItgA6 and ItgB7) were found to be up-regulated in Amdc-s and -as cells. ItgA6 was shown to dimerize mainly with ItgB1 in Amdc-s. Inhibition of ItgA6 or ItgB1 function with neutralizing antibodies fully blocked the invasiveness of Amdc-s cells, and importantly also human HT-1080 fibrosarcoma cells, in three-dimensional (3D)-Matrigel mimicking tumor extracellular matrix (ECM). By immunohistochemical analyses, strong staining for ITGA6 was detected in human high-grade fibrosarcomas and other sarcomas, especially at the invasion fronts of the tumors. In the studied melanoma cell lines, the expression levels of the adhesion-related ECM proteins tenascin-C (TN-C), fibronectin (FN), and transforming growth factor beta-induced (TGFBI) were found to be highly up-regulated. By immunohistochemistry, intense TN-C and FN staining was detected in invasive and metastatic melanoma tumors, showing co-localization (together with procollagen-I) in tubular meshworks and channels around the invading melanoma cells. In vitro, TN-C and FN were further found to directly stimulate the migration of melanoma cells in 3D-collagen-I matrix. The third candidate protein, TGFBI, was found to be an anti-adhesive molecule for melanoma cells, and knockdown of its expression in metastatic melanoma cells (TGFBI-KD cells) led to dramatically impaired tumor growth in immunocompromized mice. Interestingly, the control tumors showed intense TGFBI immunostaining in the invasion fronts, showing partial co-localization with the fibrillar FN staining, whereas the small TGFBI-KD cell-induced tumors displayed amorphous, non-fibrillar FN staining. These data suggest an important role for TGFBI in FN fibrillogenesis and melanoma progression. In conclusion, we have identified several invasion-related molecules, which show potential for cancer diagnostic or prognostic markers, or therapeutic targets. Based on our previous and present fibrosarcoma studies, we propose the possibility of using ITGA6 antagonists (affecting tumor cell adhesion) in combination with TB4 inhibitors (affecting tumor cell migration) and cathepsin L inhibitors (affecting the degradation of basement membrane and ECM proteins) for the treatment of fibrosarcomas and other tumors overexpressing these molecules. With melanoma cells, in turn, we point to the importance of three secreted ECM proteins, TN-C, FN, and TGFBI, in melanoma progression. Of these, especially the potential of TN-C as a prognostic melanoma biomarker and TGFBI as a promising therapeutic target molecule are clearly worth additional studies.

Syöpä tappaa maailmanlaajuisesti yli seitsemän miljoonaa ihmistä vuodessa. Koska syöpään liittyvät kuolemat johtuvat pääasiassa (90 %) syövän leviämisestä ympäröiviin kudoksiin ja eri elimiin, on syöpäsolujen invaasiomekanismien selvittäminen olennaista uusien tehokkaampien hoitomuotojen sekä paremman diagnostiikan kehittämiseksi. Tässä työssä oli tarkoituksena identifioida kahden syöpätyypin, fibrosarkooman ja melanooman, invaasiolle olennaisia molekyylejä käyttämällä koko genomin kattavia DNA-mikrosiruanalyysejä ja erilaisia funktionaalisia määrityksiä. Lisäksi kartoitimme identifioitujen molekyylien laajempaa merkitystä tutkimalla niiden esiintymistä kliinisissä kudosnäytteissä. Fibrosarkoomasoluissa havaitsimme kahden ylituotetun molekyylin, aktiinia sitovan tymosiini beeta 4:n (TB4) ja adheesioreseptori integriini alfa 6:n (ITGA6) olevan merkityksellisiä näiden solujen invaasiolle. TB4:n ylituotto on jo aiemmin liitetty kasvainten ja etäpesäkkeiden muodostumiseen, mutta tutkimuksemme on ensimmäinen jossa on osoitettu pienimolekyylisen TB4:ää inhiboivan toksiinin estävän syöpäsolujen invaasiota. Vastaavasti ITGA6:n tai sen partnerin ITGB1:n toiminnan estäminen neutraloivilla vasta-aineilla johti solujen invaasion estymiseen. Melanoomasoluissa havaitsimme solunulkoisen matriksin tenaskiini-C (TN-C)- ja fibronektiini (FN)-proteiinien olevan ylituotettuja invasiivisissa ja metastaattisissa melanoomasoluissa sekä muodostavan erityisiä säikeisiä rakenteita invasoituvien melanoomasolujen ympärille kudosnäytteissä. Kolmannen solunulkoisen matriksin proteiinin, TGFBI:n (transforming growth factor beta induced), havaitsimme olevan ylituotettu metastaattisissa melanoomasoluissa ja toimivan melanoomasolujen adheesiota heikentävästi. Kun TGFBI:n tuotto estettiin sitä ylituottavissa melanoomasoluissa, näiden solujen kyky muodostaa kasvaimia hiirissä heikkeni huomattavasti. Muodostuneissa pienissä kasvaimissa ei enää ollut nähtävissä myöskään FN:n säikeisiä rakenteita. TGFBI:llä vaikuttaisi siten olevan merkittävä rooli melanoomakasvainten leviämisessä. Yhteenvetona näistä ja aiemmista tuloksistamme esitämme, että ITGA6:n toimintaa estäviä vasta-aineita voitaisiin yhdessä TB4:n ja proteaasi katepsiini L:n toimintaa estävien molekyylien kanssa mahdollisesti käyttää näitä proteiineja ylituottavien sarkoomien hoidossa. Invasiivisten melanoomasolujen esitämme erittävän ympärilleen tiettyjä solujen tarttumista sääteleviä solunulkoisen matriksin proteiineja, kuten TN-C:tä, FN:a ja TGFBI:tä, muokatakseen ympäröivää matriksia sopivaksi riittävän lujien, mutta ei liian lujien, tarttumiskontaktien syntymiseksi (mikä mahdollistaa solujen tehokkaan liikkumisen). Nämä molekyylit ovat siten potentiaalisia kohdemolekyylejä hyödynnettäviksi melanooman hoidossa ja diagnostiikassa.