Functions of Alphavirus Macrodomain-containing protein nsP3

Alphaviruses are positive strand RNA viruses that replicate in association with cellular membranes. The viral RNA replication complex consists of four non-structural proteins nsP1-nsP4 which are essential for viral replication. The functions of nsP1, nsP2 and nsP4 are well established, but the roles of nsP3 are mainly unknown. In this work I have clarified some of the functions of nsP3 in order to better understand the importance of this protein in virus replication. Semliki Forest virus (SFV) has been mostly used as a model alphavirus during this work, but some experiments have also been conducted with Sindbis and Chikungunya viruses. NsP3 is composed of three different protein domains. The N-terminus of nsP3 contains an evolutionarily conserved macrodomain, the central part of nsP3 contains a domain that is only found in alphaviruses, and the C-terminus of the protein is hypervariable and predicted to be unstructured. In this work I have analyzed the functions of nsP3 macrodomain, and shown that viral macrodomains bind poly(ADP-ribose) and that they do not resemble cellular macrodomains in their properties. Furthermore, I have shown that some macrodomains, including viral macrodomains of SFV and hepatitis E virus, also bind poly(A). Mutations in the ligand binding pocket of SFV macrodomain hamper virus replication but do not confer lethality, indicating that macrodomain function is beneficial but not mandatory for virus replication. The hypervariable C-terminus of nsP3 is heavily phosphorylated and is enriched in proline residues. In this work it is shown that this region harbors an SH3 domain binding motif (Sh3BM) PxRxPR through which cellular amphiphysin is recruited to viral replication sites and to nsP3 containing cytoplasmic aggregate structures. The function of Sh3BM was destroyed by a single point mutation, which led to impaired viral RNA replication in HeLa cells, pointing out the functional importance of amphiphysin recruitment by the Sh3BM. In addition, evidence is provided tho show that the endosomal localization of alphavirus replication is mediated by nsP3 and that the phosphorylation of hypervariable region might be important for the endosomal targeting. Together these findings demonstrate that nsP3 contains multiple important host interaction motifs and domains, which facilitate successful viral propagation in host cells.

Alfavirukset ovat positiivisäikeisiä RNA-viruksia, jotka lisääntyvät isäntäsolun kalvorakenteissa. Alfaviruksilla on neljä replikaatioproteiinia, joiden toiminta tunnetaan pääosin hyvin, lukuuunottamatta nsP3 replikaatioproteiinia, jonka merkitystä viruksen lisääntymiselle ei vielä tarkoin ymmärretä. Tässä työssä on tutkittu nsP3-proteiinin toimintaa ja pyritty selvittämään, miten se edistää viruksen replikaatiota. Työssä on käytetty malliviruksena pääosin Semliki Forest virusta, mutta osa kokeista on myös tehty Sindbis- ja Chikungunya viruksilla. NsP3-proteiini voidaan jakaa kolmeen eri osaan rakenteen perusteella. Proteiinin aminoterminuksessa on evoluutiossa säilynyt makro-osio, proteiinin keskimmäinen osa on kaikissa alfaviruksissa samankaltainen, ja proteiinin karboksyylipääty on sekä aminohappokoostumukseltaan että pituudeltaan vaihteleva. Tässä työssä on tutkittu makro-osioiden toimintaa ja osoitettu, että useiden eri virusten makro-osiot sitovat poly-ADP-riboosia ja polyadenylaattia, ja eroavat toiminnoiltaan isäntäsolun makro-proteiineista. Makro-osioissa olevaan ligandin sitoutumistaskuun tehdyt mutaatiot heikensivät viruksen lisääntymiskykyä, mutteivät estäneet lisääntymistä kokonaan, mikä osoittaa, että makrodomeenin toiminta on virukselle hyödyllistä, muttei välttämätöntä. NsP3-proteiinin karboksyylipäädyn puoleinen kolmannes sisältää runsaasti proliinia sekä fosforyloituja aminohappoja. Tässä työssä on osoitettu, että proliinipitoiset aminohappojaksot ovat toimivia SH3-domeenin sitoja -motiiveja, jotka sitovat isäntäsolun amfifysiiniä. NsP3 proteiini sitoo amfifysiiniä viruksen replikaatiokeskuksiin sekä nsP3-pitoisiin proteiiniaggregaatteihin. Kun SH3-domeenin sitoja -motiivi tuhottiin pistemutaatiolla, viruksen replikaatio HeLa soluissa heikentyi, mikä osoittaa motiivin olevan tärkeä viruksen toiminnalle. Lisäksi tämän työn tulokset viittaavat siihen, että nsP3-proteiinin fosforylointi on tärkeää, viruksen replikaatiokompleksien ohjaamisessa endosomeihin. Tässä työssä kerätyt tulokset osoittavat, että nsP3-proteiini sisältää useita tärkeitä motiiveja ja domeeneja, joiden välityksellä virus vaikuttaa isäntäsolun toimintaan parantaen viruksen lisääntymisedellytyksiä.