Sterol-binding proteins in late endosomes : Regulation of endosome motility and lipid metabolism

Despite its bad reputation in the mass media, cholesterol is an indispensable constituent of cellular membranes and vertebrate life. It is, however, also potentially lethal as it may accumulate in the arterial intima causing atherosclerosis or elsewhere in the body due to inherited conditions. Studying cholesterol in cells, and research on how the cell biology of cholesterol affects on system level is essential for a better understanding of the disease states associated with cholesterol and for the development of new therapies for these conditions. On its way to the cell, exogenous cholesterol traverses through endosomes, transport vesicles involved in internalizing material to cells, and needs to be transported out of this compartment. This endosomal pool of cholesterol is important for understanding both the common disorders of metabolism and the more rare hereditary disorders of cholesterol metabolism. The study of cholesterol in cells has been hampered by the lack of bright fluorescent sterol analogs that would resemble cholesterol enough to be used in cellular studies. In the first study of my thesis, we present a new sterol analog, Boron-Dipyrromethene (BODIPY)-cholesterol for visualizing sterols in living cells and organism. This fluorescent cholesterol derivative is shown to behave similarly to cholesterol both by atomic scale computer simulations and biochemical experiments. We characterize its localization inside different types of living cells and show that it can be used to study sterol trafficking in living organisms. Two sterol binding proteins associated with the endosomal membrane; the Niemann-Pick type C disease protein 1 (NPC1) and the Oxysterol Binding Protein Related Protein 1 (ORP1) are the subjects of the rest of this study. Sensing cholesterol on endosomes, transporting lipids away from this compartment and the effects these lipids play on cellular metabolism are considered. In the second study we characterize how the NPC1 protein affects lipid metabolism. We show that this cholesterol binding protein affects synthesis of triglycerides and that genetic polymorphisms or a genetic defect in the NPC1 gene affect triglyceride on the whole body level. These effects take place via regulation of carbon fluxes to different lipid classes in cells. In the third part we characterize the effects of another endosomal sterol binding protein, ORP1L on the function and motility of endosomes. Specifically we elucidate how a mutation in the ability of ORP1L to bind sterols affects its behavior in cells, and how a change in ORP1L levels in cells affects the localization, degradative capacity and motility of endosomes. In addition we show that ORP1L manipulations affect cholesterol balance also in macrophages, a cell type important for the development of atherosclerosis.

Kolesteroli on huonosta maineestaan huolimatta tarpeellinen osa ihmiselimistöä. Solut käyttävät sitä mm. solukalvojen ja sukuhormonien rakennusaineena. Vaikka paljon tiedetään jo kolesterolista ja sen aiheuttamista riskeistä terveydelle, kolesterolin solubiologia ja sen vaikutukset kolesteroliin liittyvien sairauksien syntyyn ovat edelleen huonosti kuvattuja. Kolesterolin tutkimusta on hidastanut se, ettei sitä voi nähdä soluissa, ilman että siihen liitetään väriaine, eikä tällaista menetelmää eläville soluille ole ollut olemassa. Tutkimuksessa kuvaamme fluoresoivan kolesterolijohdoksen, BODIPY-kolesterolin käyttäytymistä soluissa ja sen käyttöä mikroskopiassa. Osoitamme, että BODIPY-kolesteroli käyttäytyy elävissä soluissa kyllin samanlaisesti kuin luonnollinen kolesteroli, jotta sen avulla voidaan tehdä johtopäätöksiä kolesterolin biologiasta. Tämä uusi menetelmä mahdollistaa kolesterolin liikkeen visualisoimisen elävissä soluissa ja organismeissa. Tämän lisäksi tutkimme kahden endosomi-soluelimissä sijaitsevan, kolesterolia sitovan proteiinin vaikutusta eri solumalleissa. Osoitimme että eräs tällainen proteiini, NPC1, vaikuttaa kolesterolin lisäksi myös toisen lipidiluokan, triglyseridien aineenvaihduntaan. Hiirillä, joilta NPC1 puuttuu, on matalat triglyseridiarvot maksassa ja verenkierrossa. Orgaanisten hiiliyksiköiden käyttö maksasoluissa triglyseridien rakennukseen on vähentynyt, samanaikaisesti kun hiilen käyttö kolesterolimolekyylien rakennukseen on lisääntynyt. Osoitimme myös, että pienet geneettiset muutokset ihmisen NPC1 geenissä vaikuttavat veren triglyseridiarvoihin populaatiotasolla. Toinen endosomeihin sijoittuva, kolesterolia sitova proteiini, ORP1L vaikuttaa endosomien liikkuvuuteen solujen sisällä. Endosomit liikkuvat normaalisti kuljettaen lastia solujen pinnalta lysosomeihin. Kun ORP1L poistetaan soluista, tämä liike muuttuu epänormaalin nopeaksi. Päinvastoin ORP1L proteiinin määrää lisäämällä, näiden soluelinten liike hidastuu. ORP1L-proteiinin kolesterolia sitomaan kykenemätön mutantti muoto muuttaa lisäksi endosomien sijaintia solujen sisällä, osoittaen että solujen kolesterolimäärä vaikuttaa endosomien paikkaan ja liikkeeseen soluissa. Tämä proteiini ja sen kolesterolia sitomaton mutanttimuoto vaikuttavat myös valtimonrasvoittumistaudin kannalta tärkeiden solujen, makrofagien kolesterolin käsittelyyn. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että kolesterolin käsittely solutasolla myötävaikuttaa siihen, miten elimistö käsittelee kolesterolia ja muita rasvoja. Lopulta nämä solutason tapahtumat vaikuttavat rasvoihin liittyvien tautien (kuten valtimonrasvoittumistaudin ja rasvamaksan) ilmenemiseen ja etenemiseen.