Porlyl oligopeptidase in development

Prolyl oligopeptidase (POP, prolyl endopeptidase, EC 3.4.21.26) is a serine-type peptidase (family S9 of clan SC) hydrolyzing peptides shorter than 30 amino acids. POP has been found in various mammalian and bacterial sources and it is widely distributed throughout different organisms. In human and rat, POP enzyme activity has been detected in most tissues, with the highest activity found mostly in the brain. POP has gained scientific interest as being involved in the hydrolyzis of many bioactive peptides connected with learning and memory functions, and also with neurodegenerative disorders. In drug or lesion induced amnesia models and in aged rodents, POP inhibitors have been able to revert memory loss. POP may have a fuction in IP3 signaling and it may be a possible target of mood stabilizing substances. POP may also have a role in protein trafficking, sorting and secretion. The role of POP during ontogeny has not yet been resolved. POP enzyme activity and expression have shown fluctuation during development. Specially high enzyme activities have been measured in the brain during early development. Reduced neuronal proliferation and differentation in presence of POP inhibitor have been reported. Nuclear POP has been observed in proliferating peripheral tissues and in cell cultures at the early stage of development. Also, POP coding mRNA is abundantly expressed during brain ontogeny and the highest levels of expression are associated with proliferative germinal matrices. This observation indicates a special role for POP in the regulation of neurogenesis during development. For the experimental part, the study was undertaken to investigate the expression and distribution of POP protein and enzymatic activity of POP in developing rat brain (from embryonic day 14 to post natal day 7) using immunohistochemistry, POP enzyme activity measurements and western blot-analysis. The aim was also to find in vivo confirmation of the nuclear colocalization of POP during early brain ontogeny. For immunohistochemistry, cryosections from the brains of the fetuses/rats were made and stained using specific antibody for POP and fluorescent markers for POP and nuclei. The enzyme activity assay was based on the fluorescence of 7- amino-4-methylcoumarin (AMC) generated from the fluorogenic substrate succinyl-glycyl-prolyl-7-amino-4-methylcoumarin (Suc-Gly-Pro-AMC) by POP. The amounts of POP protein and the specifity of POP antibody in rat embryos was confirmed by western blot analysis. We observed that enzymatic activity of POP is highest at embryonic day 18 while the protein amounts reach their peak at birth. POP was widely present throughout the developmental stages from embryonic day 14 to parturition day, although the POP-immunoreactivity varied abundantly. At embryonic days 14 and 18 notably amounts of POP was distributed at proliferative germinal zones. Furthermore, POP was located in the nucleus early in the development but is transferred to cytosol before birth. At P0 and P7 the POP-immunoreactivity was also widely observed, but the amount of POP was notably reduced at P7. POP was present in cytosol and in intercellular space, but no nuclear POP was observed. These findings support the idea of POP being involved in specific brain functions, such as neuronal proliferation and differentation. Our results in vivo confirm the previous cell culture results supporting the role of POP in neurogenesis. Moreover, an inconsistency of POP protein amounts and enzymatic activity late in the development suggests a strong regulation of POP activity and a possible non-hydrolytic role at that stage.

Prolyylioligopeptidaasi (POP, prolyyliendopeptidaasi, EC 3.4.21.26) on seriinityyppinen entsyymi, joka hydrolysoi alle 30 aminohappoa sisältäviä peptidejä. POP-entsyymi on jakautunut laajasti eri organismeissa. Ihmisessä ja rotassa, POP entsyymiaktiivisuutta on löydetty melkein kaikista kudoksista, suurin aktiivisuus on mitattu aivoista. POP kykenee hydrolysoimaan monia bioaktiivisia peptidejä, jotka on yhdistetty muisti- ja oppimistoimintoihin sekä neurodegeneratiivisiin oireisiin. Tästä johtuen POP on ollut tieteellisesti kiinnostava. POP-inhibiittoreilla on pystytty parantamaan muistitoimintoja jyrsijöillä tehdyissä koemalleissa, joissa muistinmenetys on indusoitu lääkkeellä tai leesiolla. POP saattaa olla mukana IP3-signaaliketjussa ja se saattaa toimia mielialaa tasaavien lääkkeiden vaikutuspaikkana. POP:lla saattaa olla rooli myös solunsisäisten proteiinien lajittelussa, liikennöinnissä ja erityksessä. POPin roolia myös yksilönkehityksessä on tutkittu, mutta se on säilynyt arvoituksena. POP entsyymiaktviisuus ja ekspressio vaihtelevat kehityksen aikana. Erityisen korkeita entsyymiaktiivisuuksia on mitattu aivoissa varhaiskehityksen aikana. POP-inhibiittorin on raportoitu vähentävän neuronaalista proliferaatiota ja erilaistumista. Sytosolisen POP-entsyymin lisäksi tumassa olevaa POP:ia on havaittu perifeerisissä kudoksissa joissa on aktiivista solunjakautumista sekä soluviljelmissä varhaiskehityksen aikana. Myös entsyymin lähettiRNA:ta on havaittu runsaasti aivojen kehityksen aikana ja suurimmat pitoisuudet on löydetty jaukautuvista germinaalikerroksista. Nämä havainnot vihjaavat POP:illa olevan erityisrooli neurogeneesin säätelyssä kehityksen aikana. Kokeellisen osan tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia POP-proteiinin esiintymistä ja jakautumista sekä POP entsyymiaktiivisuutta kehittyvissä rotan aivoissa sikiöasteelta viikon ikäiseen rottaan saakka. Menetelminä käytettiin immunohistokemiaa, entsyymiaktiivisuusmäärityksiä sekä western blot-analyysia. Tutkimuksen tarkoitus oli myös tutkia POP-proteiinin mahdollista esiintymistä tumassa kehittyvässä keskushermostossa. Immunohistokemiaa varten sikiöiden/rottien aivoista, tehtiin jääleikkeitä. Jääleikkeet värjättiin fluoresoivan leiman sisältävillä vasta-aineilla kaksoisvärjäyksenä jolloin kudoksesta saatiin näkyviin POP sekä solujen tumat. Leikkeet tutkittiin konfokaalimikroskoopilla. Entsyymiaktiviisuusmittaus perustui fluoresoivan 7- amino-4-methylcoumariinin (AMC) muodostumiseen POPin hydrolysoidessa sukkinyyli-glysyyli-prolyyli-7-amino-4-metyylikumariinia (Suc-Gly-Pro-AMC). POP-proteiinin määrä sekä POP-vasta-aineen spesifiteetti rotan sikiöissä määritettiin Western blot-menetelmällä. POP entsyymiaktiivisuus oli suurinta 18 päivän ikäisissä sikiöissä, kun taas POP-proteiinimäärät olivat suurimpia syntymähetkellä. POP-proteiinia oli runsaasti aivoissa koko kehityksen ajan sikiökaudelta syntymään saakka, mutta määrissä oli eroavaisuuksiakin. 14 ja 18 päivää vanhoissa sikiöissä suuria määriä POP:ia esiintyi jakautuvissa germinaalikerroksissa. Lisäksi, näillä alueilla oli havaittavissa myös tumassa olevaa POP-proteiinia joka kuitenkin siirtyi sytosoliin ennen syntymää. Syntymän kohdalla sekä viikon vanhoissa poikasissa POP-proteiinia oli huomattavasti vähemmän kuin varhaisemmissa kehitysvaiheissa. POP oli läsnä sytosolissa sekä soluväleissä, mutta ei tumassa. Nämä havinnot tukevat aikaisempia tutkimuksia ja ajatusta siitä, että POP osallistuisi erityisiin aivojen kehitykseen liittyviin tehtäviin, kuten hermojen kasvuun ja erilaistumiseen. Tutkimuksen tulokset vahvistavat aikaisemmat soluviljelmillä saadut tulokset POP:in mahdollisesta roolista neurogeneesissa. Lisäksi ristiriita POP entsyymiaktiivisuuden ja proteiinimäärien suhteen vihjaa voimakkaaseen POP-aktiivisuuden säätelyyn ja mahdolliseen ei-hydrolyyttiseen tehtävään aivojen kehityksessä.

Farmasian tiedekunta, farmakologia