Phospholipid cytochrome c interactions

The ability of the peripherally associated membrane protein cytochrome c (cyt c) to bind phospholipids in vitro was studied using fluorescence spectroscopy and large unilamellar liposomes. Previous work has shown that cyt c can bind phospholipids using two distinct mecha- nisms and sites, the A-site and the C-site. This binding is mediated by electrostatic or hydrophobic interactions, respectively. Here, we focus on the mechanism underlying these interactions. A chemically modified cyt c mutant Nle91 was used to study the ATP-binding site, which is located near the evolutionarily invariant Arg 91 on the protein surface. This site was also demonstrated to mediate phospholipid binding, possibly by functioning as a phospholipid binding site. Circular dichroism spectroscopy, time resolved fluorescence spectroscopy of zinc- porphyrin modified [Zn2+-heme] cyt c and liposome binding studies of the Nle91 mutant were used to demonstrate that ATP induces a conformational change in membrane- bound cyt c. The ATP-induced conformational changes were mediated by Arg 91 and were most pronounced in cyt c bound to phospholipids via the C-site. It has been previously reported that the hydrophobic interaction between phospho- lipids and cyt c (C-site) includes the binding of a phospholipid acyl chain inside the protein. In this mechanism, which is known as extended phospholipid anchorage, the sn-2 acyl chain of a membrane phospholipid protrudes out of the membrane surface and is able to bind in a hydrophobic cavity in cyt c. Direct evidence for this type of bind- ing mechanism was obtained by studying cyt c/lipid interaction using fluorescent [Zn2+- heme] cyt c and fluorescence quenching of brominated fatty acids and phospholipids. Under certain conditions, cyt c can form fibrillar protein-lipid aggregates with neg- atively charged phospholipids. These aggregates resemble amyloid fibrils, which are involved in the pathogenesis of many diseases. Congo red staining of these fibers con- firmed the presence of amyloid structures. A set of phospholipid-binding proteins was also found to form similar aggregates, suggesting that phospholipid-induced amyloid formation could be a general mechanism of amyloidogenesis.

Väitöskirjatyössä tutkittiin sytokromi c:n sitoutumista fosfolipideihin käyttäen biofysikaalisia tutkimusmenetelmiä. Sytokromi c on mitokondrioiden elektroninsiirtoketjuun kuuluva proteiini, joka toimii sitoutuneena mitokondrion sisäkalvon fosfolipideihin. Sytokromi c:lle tunnetaan soluissa myös toinen keskeinen tehtävä ohjelmoidun solukuoleman välittäjänä. Tärkeiden biologisten tehtäviensä vuoksi sytokromi c on kiinnostava tutkimuskohde ja sen toiminnan molekyylitason mekanismien selvittäminen tarpeellista. Kahdessa ensimmäisessä osatyössä tutkittiin sytokromi c:n sitoutumista fosfolipidikalvoihin ja todettiin proteiinin pinnalla evoluution kuluessa muuttumattomana säilyneen aminohapon arginiini 91:n osallistuvan fosfolipidien sitoutumiseen. Sama alue proteiinin pinnalla muodostaa myös sitoutumiskohdan adenosiinitrifosfaatille (ATP). Toisessa osatyössä keskityttiin ATP:n vaikutuksiin fosfolipideihin situtuneessa sytokrpmi c:ssa. Tulosten perusteella ATP aikaansaa fosfolipidikalvoihin sitoutuneessa sytokromi c:ssa konformaatiomuutoksia. Näiden muutosten myötä ATP:n on mahdollista säädellä sytokromi c:n aktiivisuutta sekä soluhengityksessä että ohjelmoidussa solukuolemassa. Kolmas osatyö käsittelee sytokromi c:n sitoutumista fosfolipidikalvoihin hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet vesiliukoisen ja pinnaltaan voimakkaasti positiivisesti varautuneen sytokromi c:n voivan sitoutua solukalvoihin hydrofobisesti. Tämän sitoutumisen mekanismiksi on esitetty proteiinin sitoutumista fosfolipidikalvoon rasvahappo-ankkurilla. Rasva-happoankkurin mahdollistaa fosfolipidikonformaatio jossa toinen fosfolipidin rasvahappoketjuista suuntautuu ulos kaksoiskalvosta ja sitoutuu kalvon pinnalla olevan proteiinin sisällä olevaan hydrofobiseen kanavaan. Tutkimuksessa osoitettiin modifioidun sinkki-sytokromi c:n ja bromirasvahappojen avulla fosfolipidin rasvahapon sitoutuminen kalvon pinnalle olevan sytokromi c:n sisälle. Viimeisessä osatyössä esitellään havainto jonka mukaan sopivissa olosuhteissa sytokromi c ja joukko muita solukalvoille sitoutuvia proteiineja muodostaa amyloidisäikeiden kaltaisia rakenteita yhdessä fosfolipidien kanssa. Amyloidikertymät liittyvät useisiin sairauksiin, esimerkkeinä Alzheimerin tauti, systeeminen amyloidoosi ja prionitaudit. Havaitsimme että rakenteeltaan normaalit proteiinit muuntuvat amloidiksi fosfolipidien vaikutuksesta fysiologisen kaltaisissa olosuhteissa. Havainnon perusteella vaikuttaa mahdolliselta että fosfolipideillä on merkittävä rooli amyloidisairauksien synnyssä.