Understanding Human Drug Conjugating Enzymes; Regio- and Stereoselectivity in Sulfotransferase 1A3 and the UDP-Glucuronosyltransferases

Sulfotransferases (SULTs) and UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) are important detoxification enzymes and they contribute to bioavailability and elimination of many drugs. SULT1A3 is an extrahepatic enzyme responsible for the sulfonation of dopamine, which is often used as its probe substrate. A new method for analyzing dopamine-3-O-sulfate and dopamine-4-O-sulfate by high-performance liquid chromatography was developed and the enzyme kinetic parameters for their formation were determined using purified recombinant human SULT1A3. The results show that SULT1A3 strongly favors the 3-hydroxy group of dopamine, which indicates that it may be the major enzyme responsible for the difference between the circulating levels of dopamine sulfates in human blood. All 19 known human UGTs were expressed as recombinant enzymes in baculovirus infected insect cells and their activities toward dopamine and estradiol were studied. UGT1A10 was identified as the only UGT capable of dopamine glucuronidation at a substantial level. The results were supported by studies with human intestinal and liver microsomes. The affinity was low indicating that UGT1A10 is not an important enzyme in dopamine metabolism in vivo. Despite the low affinity, dopamine is a potential new probe substrate for UGT1A10 due to its selectivity. Dopamine was used to study the importance of phenylalanines 90 and 93 in UGT1A10. The results revealed distinct effects that are dependent on differences in the size of the side chain and on the differences in their position within the protein. Examination of twelve mutants revealed lower activity in all of them. However, the enzyme kinetic studies of four mutants showed that their affinities were similar to that of UGT1A10 suggesting that F90 and F93 are not directly involved in dopamine binding in the active site. The glucuronidation of β-estradiol and epiestradiol (α-estradiol) was studied to elucidate how the orientation of the 17-OH group affects conjugation at the 3-OH or the 17-OH of either diastereomer. The results show that there are clear differences in the regio- and stereoselectivities of UGTs. The most active isoforms were UGT1A10 and UGT2B7 demonstrating opposite regioselectivity. The stereoselectivities of UGT2Bs were more complex than those of UGT1As. The amino acid sequences of the human UGTs 1A9 and 1A10 are 93% identical, yet there are large differences in their activity and substrate selectivity. Several mutants were constructed to identify the residues responsible for the activity differences. The results revealed that the residues between Leu86 and Tyr176 of UGT1A9 determine the differences between UGT1A9 and UGT1A10. Phe117 of UGT1A9 participated in 1-naphthol binding and the residues at positions 152 and 169 contributed to the higher glucuronidation rates of UGT1A10. In summary, the results emphasize that the substrate selectivities, including regio- and stereoselectivities, of UGTs are complex and they are controlled by many amino acids rather than one critical residue.

Lääkeaineet vaikuttavat elimistöön, mutta myös elimistö vaikuttaa lääkeaineisiin. Elimistö muuttaa lääkeaineita toisiksi yhdisteiksi entsyymien avulla ja tätä prosessia kutsutaan lääkeainemetaboliaksi. Entsymaattiset reaktiot suojelevat elimistöä myös muilta haitallisilta yhdisteiltä ja samat entsyymit metaboloivat lisäksi useita elimistön omia yhdisteitä, kuten hormoneja ja välittäjäaineita. Väitöskirja käsittelee lääkeainemetabolian kannalta keskeisten entsyymien toimintaa ja auttaa ymmärtämään niiden substraattiselektiivisyyttä. Tulokset voivat edistää uusien lääkeaineiden varhaisvaiheen metaboliatutkimuksen ennustemallien kehittämistä. Väitöstyö tarkastelee metaboliaentsyymeihin kuuluvia uridiinidifosfoglukuronosyylitransferaaseja (UGT) ja erästä sulfotransferaasia (SULT1A3). Ne katalysoivat glukuronihapon ja sulfoniryhmän liittymistä kohdeaineisiinsa eli substraatteihinsa, jotka ovat pieniä, rasvaliukoisia yhdisteitä. Tutkitut entsyymit muuttavat kohdeaineiden rakenteita vesiliukoisemmiksi. Samalla rasvaliukoisten yhdisteiden eritys sappeen ja virtsaan nopeutuu. Tutkitut entsyymit tuotettiin geenitekniikan avulla bakteeri- ja hyönteissoluissa. Tutkimus keskittyy siihen, millaisia yhdisteitä nämä entsyymit hyväksyvät kohdeaineikseen ja miten yhdisteiden rakenteelliset erot vaikuttavat niiden sitoutumiseen entsyymeihin. Työ käsittelee myös entsymaattisten reaktioiden nopeutta. Entsyymien paikka- ja stereoselektiivisyyttä tutkittiin malliaineiden avulla. Malliaineissa oli enemmän kuin yksi kohta, joihin sulfoniryhmä tai glukuronihappo saattoivat liittyä. Malliaineina käytettiin myös kiraalisia yhdisteitä, joiden isomeerien kolmiulotteiset rakenteet poikkeavat toisistaan. Lisäksi mutaatioiden avulla tutkittiin sitä, miten entsyymien UGT1A9 ja UGT1A10 rakenteelliset erot vaikuttavat niiden toimintaan. Ihmisen verenkierrossa yli 90 % dopamiinista on sulfaattina. SULT1A3 on tärkein entsyymi, joka muuttaa dopamiinia dopamiinisulfaatiksi. Ensimmäinen osatutkimus osoitti, että SULT1A3 tuottaa enemmän dopamiini-3-sulfaattia kuin dopamiini-4-sulfaattia, joten kyseinen entsyymi on paikkaselektiivinen. Kolme osatutkimusta käsittelivät UGT-entsyymejä. Yksi osatutkimuksista osoitti, että ainoastaan UGT1A10 katalysoi merkittävästi dopamiinin glukuronidaatiota. Ihmiselimistössä UGT1A10 ole läheskään yhtä merkittävä entsyymi dopamiinin aineenvaihdunnassa kuin SULT1A3, mutta dopamiinia voidaan kuitenkin selektiivisyytensä ansiosta mahdollisesti käyttää malliaineena tutkittaessa UGT1A10:ä. Myös estradiolin glukuronidaatiossa UGT1A10 oli yksi tärkeimmistä entsyymeistä. β-Estradiolin ja α-estradiolin (ts. epiestradiolin) glukuronidaatiota tutkittiin kaikilla UGT-entsyymeillä ja näiden paikka- ja stereoselektiivisyydessä havaittiin suuria eroja. Viimeisessä osatutkimuksessa löytyi viisi aminohappoa, jotka vaikuttavat erityisesti UGT1A9:n ja UGT1A10:n välisiin eroihin substraattiselektiivisyydessä.