Characterization of hydrophobin proteins at interfaces and in solutions using x rays

Hydrophobins are a group of particularly surface active proteins. The surface activity is demonstrated in the ready adsorption of hydrophobins to hydrophobic/hydrophilic interfaces such as the air/water interface. Adsorbed hydrophobins self-assemble into ordered films, lower the surface tension of water, and stabilize air bubbles and foams. Hydrophobin proteins originate from filamentous fungi. In the fungi the adsorbed hydrophobin films enable the growth of fungal aerial structures, form protective coatings and mediate the attachment of fungi to solid surfaces. This thesis focuses on hydrophobins HFBI, HFBII, and HFBIII from a rot fungus Trichoderma reesei. The self-assembled hydrophobin films were studied both at the air/water interface and on a solid substrate. In particular, using grazing-incidence x-ray diffraction and reflectivity, it was possible to characterize the hydrophobin films directly at the air/water interface. The in situ experiments yielded information on the arrangement of the protein molecules in the films. All the T. reesei hydrophobins were shown to self-assemble into highly crystalline, hexagonally ordered rafts. The thicknesses of these two-dimensional protein crystals were below 30 Å. Similar films were also obtained on silicon substrates. The adsorption of the proteins is likely to be driven by the hydrophobic effect, but the self-assembly into ordered films involves also specific protein-protein interactions. The protein-protein interactions lead to differences in the arrangement of the molecules in the HFBI, HFBII, and HFBIII protein films, as seen in the grazing-incidence x-ray diffraction data. The protein-protein interactions were further probed in solution using small-angle x-ray scattering. Both HFBI and HFBII were shown to form mainly tetramers in aqueous solution. By modifying the solution conditions and thereby the interactions, it was shown that the association was due to the hydrophobic effect. The stable tetrameric assemblies could tolerate heating and changes in pH. The stability of the structure facilitates the persistence of these secreted proteins in the soil.

Proteiinien rakenne määrää niiden toiminnan, eli rakenteeltaan erilaiset proteiinit ovat erikoistuneet suorittamaan eri toimintoja. Siispä proteiinien rakennetutkimus auttaa ymmärtämään proteiinien biologisia toimintamekanismeja. Toisaalta rakenteen ja toimintamekanismien tuntemusta voidaan käyttää hyväksi myös uusia biomateriaaleja ja nanomateriaaleja suunniteltaessa. Väitöskirjatyössäni olen keskittynyt eräseen mielenkiintoiseen proteiiniryhmään, hydrofobiineihin. Hydrofobiinit ovat sieniperäisiä, erittäin pinta-aktiivisia proteiineja. Hydrofobiinien pinta-aktiivisuus johtuu niiden rakenteesta. Proteiinin pinta on suurimmaksi osin hydrofiilinen (vettä suosiva), mutta siinä on pieni hydrofobinen (vettä hylkivä) osa. Pinta-aktiivisuus ilmenee hydrofobiinien hakeutumisena hydrofobisten ja hydrofiilisten materiaalien rajapinnoille, kuten veden ja ilman rajapinnalle. Rajapinnalla hydrofobiinit itsejärjestäytyvät kalvoiksi ja täten stabiloivat esimerkiksi ilmakuplia vedessä. Tässä tutkimuksessa on keskitytty Trichoderma reesei -homeesta eristettyihin hydrofobiiniproteiineihin. Proteiineja tutkittiin liuoksissa, veden ja ilman rajapinnalla ja kiinteällä alustalla röntgensäteilyn avulla. Kokeet tehtiin kansainvälisissä synkrotronitutkimuskeskuksissa Grenoblessa ja Hampurissa. Synkrotronien tuottama erittäin intensiivinen röntgensäteily mahdollisti ennen kaikkea hydrofobiinien tutkimisen suoraan veden ja ilman rajapinnalla. Pystyttiin osoittamaan, että hydrofobiinit muodostavat hyvin järjestyneen kalvon, jonka paksuus on vain noin 3 nm. Eri hydrofobiinien kalvot ovat rakenteeltaan hieman erilaisia, mikä johtunee proteiinien välisistä vuorovaikutuksista. Proteiinien vuorovaikutuksia tutkitiin myös liuoksissa. Vesiliuoksissa hydrofobiinit yhdistyivät pääsääntöisesti tetrameereiksi hydrofobisen vuorovaikutuksen takia. Hydrofobiinitetrameerit osoittautuivat hyvin stabiileiksi, eli ne kestivät hyvin lämpötilan ja happamuuden vaihteluja. Tämä stabiilisuus auttaa proteiineja selviytymään homeen ympäristössä ja on lisäksi erittäin hyödyllinen ominaisuus hydrofobiinisovellusten kannalta. Mahdolliset sovellukset pohjautuvat hydrofobiinien pinta-aktiivisuuteen ja itsejärjestäytymiseen kalvoiksi. Hydrofobiinikalvon avulla voidaan muokata pintojen ja rajapintojen ominaisuuksia tai vaikkapa ankkuroida toisia molekyylejä pinnalle. Väitöskirjatyössä saadut tiedot kalvojen rakenteesta auttavat uusien hydrofobiinipohjaisten sovellusten suunnittelussa.