Characterization of LRRTM and NGR gene families: Expression and functions

Some leucine-rich repeat (LRR) -containing membrane proteins are known regulators of neuronal growth and synapse formation. In this work I characterize two gene families encoding neuronal LRR membrane proteins, namely the LRRTM (leucine-rich repeat, transmembrane neuronal) and NGR (Nogo-66 receptor) families. I studied LRRTM and NGR family member's mRNA tissue distribution by RT-PCR and by in situ hybridization. Subcellular localization of LRRTM1 protein was studied in neurons and in non-neuronal cells. I discovered that LRRTM and NGR family mRNAs are predominantly expressed in the nervous system, and that each gene possesses a specific expression pattern. I also established that LRRTM and NGR family mRNAs are expressed by neurons, and not by glial cells. Within neurons, LRRTM1 protein is not transported to the plasma membrane; rather it localizes to endoplasmic reticulum. Nogo-A (RTN4), MAG, and OMgp are myelin-associated proteins that bind to NgR1 to limit axonal regeneration after central nervous system injury. To better understand the functions of NgR2 and NgR3, and to explore the possible redundancy in the signaling of myelin inhibitors of neurite growth, I mapped the interactions between NgR family and the known and candidate NgR1 ligands. I identified high-affinity interactions between RTN2-66, RTN3-66 and NgR1. I also demonstrate that Rtn3 mRNA is expressed in the same glial cell population of mouse spinal cord white matter as Nogo-A mRNA, and thus it could have a role in myelin inhibition of axonal growth. To understand how NgR1 interacts with multiple structurally divergent ligands, I aimed first to map in more detail the nature of Nogo-A:NgR1 interactions, and then to systematically map the binding sites of multiple myelin ligands in NgR1 by using a library of NgR1 expression constructs encoding proteins with one or multiple surface residues mutated to alanine. My analysis of the Nogo-A:NgR1 -interactions revealed a novel interaction site between the proteins, suggesting a trivalent Nogo-A:NgR1-interaction. Our analysis also defined a central binding region on the concave side of NgR1's LRR domain that is required for the binding of all known ligands, and a surrounding region critical for binding MAG and OMgp. To better understand the biological role of LRRTMs, I generated Lrrtm1 and Lrrtm3 knock out mice. I show here that reporter genes expressed from the targeted loci can be used for maping the neuronal connections of Lrrtm1 and Lrrtm3 expressing neurons in finer detail. With regard to LRRTM1's role in humans, we found a strong association between a 70 kb-spanning haplotype in the proposed promoter region of LRRTM1 gene and two possibly related phenotypes: left-handedness and schizophrenia. Interestingly, the responsible haplotype was linked to phenotypic variability only when paternally inherited. In summary, I identified two families of neuronal receptor-like proteins, and mapped their expression and certain protein-protein interactions. The identification of a central binding region in NgR1 shared by multiple ligands may facilitate the design and development of small molecule therapeutics blocking binding of all NgR1 ligands. Additionally, the genetic association data suggests that allelic variation upstream of LRRTM1 may play a role in the development of left-right brain asymmetry in humans. Lrrtm1 and Lrrtm3 knock out mice developed as a part of this study will likely be useful for schizophrenia and Alzheimer s disease research.

Ihmisen perimässä on noin 23 000 geeniä. Useimpien geenien tehtävät ovat vielä selvittämättä. Neurotieteen alaan kuuluvassa väitöskirjatyössäni kuvaan kaksi ennestään tuntematonta geeniperhettä, jotka yhteensä käsittävät kuusi geeniä. Lisäksi tutkin näiden geenien tehtäviä aivojen kehityksessä ja toiminnassa. Eräänä keskeisenä väitöskirjatyöni tuloksena selvitimme yhteistyössä tri Clyde Francksin (Oxfordin yliopisto, Iso-Britannia) kanssa, että tietty muoto löytämästämme LRRTM1-nimisestä geenistä altistaa vasenkätisyydelle. Tämä löytö on ensimmäinen tunnistettu vasenkätisyyteen liittyvä geenimuutos. Havaitsin myös, että LRRTM1-geeni toimii aktiivisesti niin hiiren kuin ihmisenkin aivoissa jo sikiökaudella. Oletamme, että LRRTM1-geeni ohjaa osaltaan vasemman ja oikean aivopuoliskon kehittymistä toisistaan eroaviksi. Toinen työni päämäärä oli selvittää NGR1-geenin ja kahden tunnistamani NGR1:n kaltaisen geenin tehtäviä. NGR-geeniperhettä koskevat tutkimukseni antavat entistä tarkemman kuvan niistä mekanismeista, jotka rajoittavat hermosäikeiden uudiskasvua esimerkiksi selkäydinvamman tai aivoinfarktin jälkeen. Tiedetään, että hermosolujen pinnalla sijaitsevaan NGR1-reseptoriin sitoutuu useita myeliiniperäisiä hermosolujen kasvua estäviä ligandeja, jotka näin ilmeisesti rajoittavat aivo- ja selkäydinvammoista toipumista. Väitöskirjatyössäni kartoitin systemaattisesti eri ligandien sitoutumista NGR1-reseptoriin. Analyysini osoitti, että NGR1-reseptorin keskiosa on kriittinen kaikkien ligandien sitoutumiselle, ja että sen ympäristössä olevat aminohapot ovat tarpeen vain yksittäisten ligandien sitoutumiselle. Tunnistin myös RTN4-ligandista kolme eri kohtaa, jotka sitoutuvat NGR1:een. Lisäksi osoitin, että RTN2- ja RTN3-proteiinit sitoutuvat NGR1-reseptoriin ja että RTN3-geeni on aktiivinen selkäytimen myeliiniä tuottavissa soluissa; RTN3:n voidaan täten olettaa osallistuvan hermosäikeiden uudiskasvun säätelyyn. Tutkimukseni myös osoittaa, että NGR1:n tavoin NGR2- ja NGR3-geenit ovat erityisen aktiivisia keskushermostossa, mutta kuitenkin niin, että kukin geeni toimii osittain eri aivoalueilla. Osana väitöskirjatyötäni tein kaksi hiirilinjaa, joista toisesta oli poistettu LRRTM1-geeni ja toisesta LRRTM3-geeni. Aiempiin soluviljelmätöihin perustuvat tulokset viittaavat siihen, että LRRTM3-geenillä on keskeinen rooli Alzheimerin tautia aiheuttavan beta-amyloidin tuotannossa. LRRTM3-poistogeeniset hiiret mahdollistavat tämän asian tarkemman tutkimisen. LRRTM1-poistogeenisten hiirten avulla puolestaan voidaan selvittää mekanismeja, jotka johtavat vasemman ja oikean aivopuoliskon välisten erojen kehittymiseen.