Hematopoietic Stem Cell Development and Transcriptional Regulation

The continuous production of blood cells, a process termed hematopoiesis, is sustained throughout the lifetime of an individual by a relatively small population of cells known as hematopoietic stem cells (HSCs). HSCs are unique cells characterized by their ability to self-renew and give rise to all types of mature blood cells. Given their high proliferative potential, HSCs need to be tightly regulated on the cellular and molecular levels or could otherwise turn malignant. On the other hand, the tight regulatory control of HSC function also translates into difficulties in culturing and expanding HSCs in vitro. In fact, it is currently not possible to maintain or expand HSCs ex vivo without rapid loss of self-renewal. Increased knowledge of the unique features of important HSC niches and of key transcriptional regulatory programs that govern HSC behavior is thus needed. Additional insight in the mechanisms of stem cell formation could enable us to recapitulate the processes of HSC formation and self-renewal/expansion ex vivo with the ultimate goal of creating an unlimited supply of HSCs from e.g. human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (iPS) to be used in therapy. We thus asked: How are hematopoietic stem cells formed and in what cellular niches does this happen (Papers I, II)? What are the molecular mechanisms that govern hematopoietic stem cell development and differentiation (Papers III, IV)? Importantly, we could show that placenta is a major fetal hematopoietic niche that harbors a large number of HSCs during midgestation (Paper I)(Gekas et al., 2005). In order to address whether the HSCs found in placenta were formed there we utilized the Runx1-LacZ knock-in and Ncx1 knockout mouse models (Paper II). Importantly, we could show that HSCs emerge de novo in the placental vasculature in the absence of circulation (Rhodes et al., 2008). Furthermore, we could identify defined microenvironmental niches within the placenta with distinct roles in hematopoiesis: the large vessels of the chorioallantoic mesenchyme serve as sites of HSC generation whereas the placental labyrinth is a niche supporting HSC expansion (Rhodes et al., 2008). Overall, these studies illustrate the importance of distinct milieus in the emergence and subsequent maturation of HSCs. To ensure proper function of HSCs several regulatory mechanisms are in place. The microenvironment in which HSCs reside provides soluble factors and cell-cell interactions. In the cell-nucleus, these cell-extrinsic cues are interpreted in the context of cell-intrinsic developmental programs which are governed by transcription factors. An essential transcription factor for initiation of hematopoiesis is Scl/Tal1 (stem cell leukemia gene/T-cell acute leukemia gene 1). Loss of Scl results in early embryonic death and total lack of all blood cells, yet deactivation of Scl in the adult does not affect HSC function (Mikkola et al., 2003b. In order to define the temporal window of Scl requirement during fetal hematopoietic development, we deactivated Scl in all hematopoietic lineages shortly after hematopoietic specification in the embryo . Interestingly, maturation, expansion and function of fetal HSCs was unaffected, and, as in the adult, red blood cell and platelet differentiation was impaired (Paper III)(Schlaeger et al., 2005). These findings highlight that, once specified, the hematopoietic fate is stable even in the absence of Scl and is maintained through mechanisms that are distinct from those required for the initial fate choice. As the critical downstream targets of Scl remain unknown, we sought to identify and characterize target genes of Scl (Paper IV). We could identify transcription factor Mef2C (myocyte enhancer factor 2 C) as a novel direct target gene of Scl specifically in the megakaryocyte lineage which largely explains the megakaryocyte defect observed in Scl deficient mice. In addition, we observed an Scl-independent requirement of Mef2C in the B-cell compartment, as loss of Mef2C leads to accelerated B-cell aging (Gekas et al. Submitted). Taken together, these studies identify key extracellular microenvironments and intracellular transcriptional regulators that dictate different stages of HSC development, from emergence to lineage choice to aging.

Kroppen kan ses som något som sköter sig själv. Ja, så länge allt går som det ska alltså. Trots att vi ser på oss själva som tämligen konstanta varelser är kroppen under ständig förändring - uppbyggnad och nedbrytning, liv och död äger rum hela tiden. Ett bra exempel på detta är vårt blodsystem; visste du t.ex. att det varje dag, helt naturligt, dör och föds ett tusen miljarder blodkroppar? Alla dessa blodkroppar behövs för att sköta blodets uppgifter, vilka är i huvudsak två: 1) att transportera syre och näring till alla vävnader i kroppen, och 2) att försvara kroppen mot skadliga organismer såsom bakterier, virus, m.fl. Dessa olika uppgifter sköts av olika slags specialiserade mogna blodkroppar: röda blodkroppar transporterar syre, blodplättar gör så att blod levrar sig, B-celler producerar antikroppar mot främmande celler, T-celler angriper bakterier via direktkontakt o.s.v. Frågan är, hur vår kropp kan skapa så många, och olika slags, celler hela tiden under hela vår livslängd? Fascinerande nog har man kommit på att de celler som ger upphov till alla blodceller i blodsystemet är en mycket liten grupp celler i benmärgen som kallas blodstamceller eller hematopoietiska stamceller (HSC). Inte nog med att de kan skapa alla slags blodceller, de är själva i det närmaste odödliga eftersom när de delar sig skapas två dotterceller varav en är en stamcell precis som modercellen. Detta kallas för självförnyelseförmåga, och stamceller är de enda cellerna i kroppen som har denna unika förmåga. Sammantaget innebär dessa förmågor att stamceller kan bygga upp ett helt blodsystem, och det utan att själva förbrukas. Med andra ord kan ett fåtal friska stamceller användas för att återuppbygga ett sjukt blodsystem. Detta har man utnyttjat i flera årtionden genom benmärgstransplantationer för att bota personer med olika slags blodsjukdomar, såsom leukemier etc. Det är därför som så mycket forskning har gjorts och görs kring stamcellerna, men mycket är fortfarande okänt. Den största utmaningen för närvarande är att få blodstamceller att föröka sig utanför kroppen. I provrör (in vitro) förlorar istället stamceller snabbt sin självförnyelseförmåga och mognar ut till mogna blodceller eller dör. Vi vet heller inte hur vi kan skapa nya stamceller, från till exempel embryonala stamceller (ES). Att lyckas med detta skulle t.ex. innebära att man skulle kunna odla blodstamceller på labb och därigenom ha en oändlig källa stamceller till transplantationsterapi av sjuka människor. Vår förhoppning är att genom att studera hur HSC bildas, delar sig och mognar under normal utveckling kan vi återskapa hematopoesen ex vivo med slutmålet att förbättra stamcellsterapier. Min avhandling har fokuserat i huvudsak på två frågeställningar: Hur och var bildas hematopoietiska stamceller under fosterutvecklingen? Hur regleras stamcellernas beteende efter att de bildats? Vår första studie (Paper I), syftade som sagt till att öka förståelsen av hur blodstamcellerna bildas i embryot. Det paradoxala i embryonal hematopoes är att blodceller skapas innan det överhuvudtaget har bildats några stamceller. Denna s.k. primitiva vågen av hematopoes inträffar i gulesäcken och syftar till att ge embryot blodceller så den kan överleva tills den s.k. definitiva, vågen av hematopoes (som härstammar från stamceller) har påbörjats. Man visste sedan hundra år tillbaka att en vävnad gulesäcken kunde bilda röda blodkroppar, men det var okänt var HSC bildas tills för knappt femton år sedan. Då kunde man visa att de första blodstamcellerna i däggdjursembryon bildas i ett blodkärl som kallas AGM (aorta-gonad-mesonephros regionen). Dessa stamceller lämnar AGM och åker via blodet till den fetala levern (FL) där de kan expandera och bilda främst röda blodkroppar, men också alla andra blodcellstyper. Därefter, en kort tid innan födseln flyttar stamcellerna från levern till den nyskapade benmärgen, och fortsätter att skapa blod där under hela livet. Denna modell har dock förföljts av vissa frågetecken. Ett av dem var att antalet stamceller som finns i AGM en dag innan de påträffas i levern är för få för att ge upphov till så många stamceller som finns i levern dagen efter. Det har spekulerats i att kanske omogna stamceller från gulesäcken kunde också migrera till levern eller kanske det fanns ytterligare en annan, okänd, plats där blodstamceller bildades. Intressant nog hade man i fågelembryon identifierat en fetal vävnad, (allantois), som utöver gulesäck och aorta hade blodbildningspotential. I däggdjursembryon bildar allantois placentan (dvs moderkakan), och därför var det intressant för oss att undersöka om placentan hade en roll i blodbildning, utöver dess självklara funktion som barriär mellan moder/foster, och syre och näringstransport. Vår första studie (Paper I, Gekas et al. 2005) gick därför ut på att utreda om också blodstamceller bildas, utvecklas och/eller mognar i placenta. Genom att dissekera ut placenta och andra vävnader från musembryon i olika dagar i utvecklingen (E) och transplantera dessa celler in i vuxna möss som bestrålats för att förlora sina egna stamceller kunde vi räkna ut antalet stamceller i varje organ. Vi kom fram till att inte nog med att stamceller finns i placenta lika tidigt som de påträffas i AGM (E10.5), men att de till skillnad från i AGM expanderar kraftigt i placentan. Stamcellsexpansionen i placentan är avsevärd: i E12.5 finns ca. 50 HSC där jämfört med 3 i AGM och 100 i levern. Mycket intressant var också vårt fynd att till skillnad från levern, där blodstamceller differentierar kraftigt, äger ingen större differentiering rum i placenta. Detta innebär att de lokala signalerna från placentan skiljer sig från leverns och gynnar stamcellernas förökning istället för mognad. Vi kunde alltså visa att placentan har en ytterst viktig roll i fetal stamcellsutveckling. På grund av att blodcirkulationen är igång redan E9.5 kunde vi inte dock veta om HSC faktiskt bildas i placenta eller om de kommer från AGM och stannar kvar/expanderar där. För att svara på denna fråga använde vi oss av två musmodeller i vår andra studie (Paper II, Rhodes et al. 2008). Den ena modellen var en genetiskt modifierad muslinje som uttrycker LacZ-genen i alla celler där genen Runx1 är aktivt. Runx1 är en viktig hematopoietisk transkriptionsfaktor (dvs ett protein som kan binda till speciella DNA-sekvenser och läsa dem så att genen i fråga uttrycks). Runx1 uttrycks i alla definitiva blodceller och förlust av Runx1 leder till att inga definitiva blodceller skapas i embryot. Därför, genom att använda oss av en särskild färgningsteknik där LacZ+ celler blir blåa kunde vi identifiera blodceller som håller på att bildas. Viktigt nog kunde vi hitta LacZ+ celler i de s.k. chorioallantoiska (CA) blodkärlen i placentan i såväl Runx1LacZ/LacZ som Runx1LacZ/+ möss, medan det i s.k. labyrinten bara fanns LacZ+ celler i Runx1LacZ/+ möss. Genom att färga med en andra färg som avslöjar mitos, dvs aktiv celldelning, kunde vi visa att bara de senare cellerna delar sig. Förenklat betyder detta att blodceller faktiskt kan skapas i placentan (i CA), och att det därutöver finns en specialiserad mikromiljö (labyrinten) där stamceller inte skapas utan snarare expanderar. Vidare använde vi oss av en s.k. knockout musmodell, där en gen (i vårt fall Ncx1) har deleterats. Ncx1 är en gen som kodar för en natrium-kalcium pump i hjärtat, och utan den kan hjärtat aldrig slå. Ncx1-/- musembryon dör därför efter E9.5, och eftersom de saknar hjärtfunktion har de heller ingen blodcirkulation. Vi använde denna modell för att svara på frågan om de stamceller som finns i placenta bildas där. Genom att undersöka förmågan av fetala organ från E9.5 Ncx1-/- embryon att bilda myeloida och lymfoida celler i speciella in vitro kulturer på OP9 och OP9-DL1 stroma kunde vi visa att stamceller faktiskt bildas i placenta. Sammantaget har vi alltså identifierat en tidigare okänd ny vävnad där stamceller både bildas och expanderar kraftigt utan att differentiera nämnvärt. Det är av högsta intresse att förstå egenskaperna av den unika mikromiljön som finns i placenta och som stödjer stamcellsutveckling. Vår andra frågeställning var att förstå bättre hur stamcellers utveckling och mognadsval regleras av transkriptionsfaktorer. Transkriptionsfaktorn Scl (stem cell leukemia gene) är ytterst viktigt för bildandet av allt blod, eftersom Scl knockout embryon varken bildar blodstamceller eller något blod. Det ansågs därför att Scl var viktig för funktionen av stamceller. Överraskande visades det dock att konditionell deletering av Scl i vuxna möss inte orsakade förlust av stamcellerna. Däremot fanns problem i utvecklingen av två blodlinjer, nämligen röda blodkroppar och blodplättar. Detta visade att Scl, till skillnad från vad man tidigare trott, inte var viktigt för vuxna stamcellers funktion. Vår tredje studie (Paper III, Schlaeger et al. 2005) syftade till att förstå hur tidigt efter det att stamceller bildats som Scl inte längre behövs för deras funktion. Vi använde oss av en konditionell Sclfl/fl musmodell och korsade den med en Tie2-Cre muslinje, vilket medför att Scl deleteras i alla blodkärlsceller (endotel) och hematopoietiska från E12.5 och framåt, dvs kort efter bildningen av de första stamcellerna. Intressant nog kunde vi visa att de fetala stamcellernas funktion inte var påverkat trots tidig förlust av Scl. Också i likhet med deletering i vuxna möss var röda blodkroppars och blodplättars utveckling hindrat. Sammantaget visar dessa studier att Scl behövs endast under en väldigt kort period under embryonal utveckling för att starta hela blodprogrammet och för att blodstamceller ska bildas, och att när detta program är igång behålls blodidentiteten av andra, skilda, mekanismer. Intressant nog återanvänds Scl längre ner i blodhierarkin för normal utveckling av röda blodkroppar och blodplättar. Detta föreslår att Scl s målgener är olika beroende på celltyp och situation under utvecklingen. Trots att Scl är så viktigt för blodbildning är det inte känt vilka dess kritiska målgener är. Vår fjärde studie (Paper IV, Gekas et al. 2008) syftade därför att identifiera nya målgener av Scl. Vi använde oss av den konditionella Sclfl/fl musmodellen och skapade cellinjer från E12.5 fetal lever som vi kunde manipulera in vitro. Genom att utsätta dessa celler till genetiskt modifierad virus som uttrycker proteinet Cre kunde vi deletera Scl, samt sedan återinföra Scl via ett virus som uttrycker Scl. Dessa tre cellinjerna analyserades med s.k. microarray analysis. Microarray testar uttrycket av de flesta generna som finns i musgenomet. Därmed kunde vi leta efter gener vars uttryck minskade när Scl var deleterat och som sedan ökade igen när Scl återinfördes, dvs möjliga målgener till Scl. Intressant nog identifierade vi transkriptionsfaktorn Mef2C som en möjlig målgen. Genom ChIP-on-chip analys kunde vi bevisa att Scl binder direkt på Mef2C-promotorn i megakaryocyter (dvs de celler som skapar blodplättar) men inte i röda blodceller (där Mef2C inte uttrycks). Mef2C är viktig för utvecklingen av skelett-, hjärt- och glatt muskulatur och det var inte känt tills mycket nyligen att Mef2C hade någon roll i blodsammanhang. Vi testade därför om Mef2C hade samma roll som Scl under embryobildning, genom att analysera Mef2C-knockout möss. Till skillnad från Scl bildades det blod i gulesäcken av Mef2C-/- embryon, och placenta, gulesäck och AGM hade förmågan att skapa myeloida och lymfoida celler in vitro. Eftersom Mef2C-/- möss dör vid E9.5 pga hjärt- och kärlproblem kunde vi inte analysera om Mef2C behövdes i det vuxna blodsystemet. Därför använde vi en konditionell Mef2Cfl/fl muslinje som vi korsade med en VavCre muslinje. Vav uttrycks i hela blodsystemet och Mef2C deleterades helt i alla blodceller fr.o.m E12.5. De flesta blodparametrarna (som t.ex. halten hemoglobin, antalet röda blodkroppar m.m), var normala i vuxna VavCreMef2Cfl/fl möss. Däremot hade alla dessa möss trombocytopeni, dvs mycket lägre antal blodplättar i blodet. Dessa plättar var samtidigt mycket större än vanligt, och elektronmikroskopi avslöjade att de hade samma morfologi som Scl-deficienta blodplättar. I benmärgen där blodplättsproduktionen äger rum var dock nivån av megakaryocyter och deras mognad till synes normal. Däremot, när vi odlade Mef2C-deficienta benmärgsceller i megakaryocyt-kultur in vitro såg vi en drastiskt minskad potential till att skapa mogna blodplättsbildande megakaryocyter. Därmed kunde vi sluta oss till att Scl s målgen Mef2C är en hittills okänd ny kritisk faktor i blodplättsutveckling. Utöver dess Scl-beroende roll i blodplättstillverkning hittade vi att Mef2C-/- möss hade lägre nivåer av B-celler i blodet, som förvärrades med ökad ålder. Intressant nog såg vi att B-cellsprogenitorer i benmärgen var tämligen normala i unga Mef2C-/- möss, men äldre (>9 månader) möss hade drastiska minskningar i de flesta progenitorpopulationerna jämfört med lika gamla normala möss. Produktionen av både B-celler och T-celler minskar med åldern naturligt hos däggdjur, inklusive människa, och är ett fenomen som kallas lymfoid åldrande (eng. lymphoid aging). Normalt sett påträffas B-cellsåldrande under andra levnadsåret i möss och blir som mest markant efter 2 år. Förlust av Mef2C ledde till drastiskt B-cellsåldrande redan vid 9 månader, vilket innebär att Mef2C har en viktig föryngringsroll i B-celler, förmodligen genom att vara en överlevnadsfaktor. Sammantaget har dessa studier upptäckt viktiga extracellulära mikromiljöer och intracellulära transkriptionsreglerande faktorer som dikterar grundläggande stadier av blodets utveckling, från bildningen av stamceller till deras differentiering och åldrande.