Ion-regulatory proreins in neuronal development and communication

Brain function is critically dependent on the ionic homeostasis in both the extra- and intracellular compartment. The regulation of brain extracellular ionic composition mainly relies on active transport at blood brain and at blood cerebrospinal fluid interfaces whereas intracellular ion regulation is based on plasmalemmal transporters of neurons and glia. In addition, the latter mechanisms can generate physiologically as well as pathophysiologically significant extracellular ion transients. In this work I have studied molecular mechanisms and development of ion regulation and how these factors alter neuronal excitability and affect synaptic and non-synaptic transmission with a particular emphasis on intracellular pH and chloride (Cl-) regulation. Why is the regulation of acid-base equivalents (H+ and HCO3-) and Cl- of such interest and importance? First of all, GABAA-receptors are permeable to both HCO3- and Cl-. In the adult mammalian central nervous system (CNS) fast postsynaptic inhibition relies on GABAA-receptor mediated transmission. Today, excitatory effects of GABAA-receptors, both in mature neurons and during the early development, have been recognized and the significance of the dual actions of GABA on neuronal communication has become an interesting field of research. The transmembrane gradients of Cl- and HCO3- determine the reversal potential of GABAA-receptor mediated postsynaptic potentials and hence, the function of pH and Cl- regulatory proteins have profound consequences on GABAergic signaling and neuronal excitability. Secondly, perturbations in pH can cause a variety of changes in cellular function, many of them resulting from the interaction of protons with ionizable side chains of proteins. pH-mediated alterations of protein conformation in e.g. ion channels, transporters, and enzymes can powerfully modulate neurotransmission. In the context of pH homeostasis, the enzyme carbonic anhydrase (CA) needs to be taken into account in parallel with ion transporters: for CO2/HCO3- buffering to act in a fast manner, CO2 (de)hydration must be catalyzed by this enzyme. The acid-base equivalents that serve as substrates in the CO2 dehydration-hydration reaction are also engaged in many carrier and channel mediated ion movements. In such processes, CA activity is in key position to modulate transmembrane solute fluxes and their consequences. The bicarbonate transporters (BTs; SLC4) and the electroneutral cation-chloride cotransporters (CCCs; SLC12) belong the to large gene family of solute carriers (SLCs). In my work I have studied the physiological roles of the K+-Cl- cotransporter KCC2 (Slc12a5) and the Na+-driven Cl--HCO3- exchanger NCBE (Slc4a10) and the roles of these two ion transporters in the modualtion of neuronal communication and excitability in the rodent hippocampus. I have also examined the cellular localization and molecular basis of intracellular CA that has been shown to be essential for the generation of prolonged GABAergic excitation in the mature hippocampus. The results in my Thesis provide direct evidence for the view that the postnatal up-regulation of KCC2 accounts for the developmental shift from depolarizing to hyperpolarizing postsynaptic EGABA-A responses in rat hippocampal pyramidal neurons. The results also indicate that after KCC2 expression the developmental onset of excitatory GABAergic transmission upon intense GABAA-receptor stimulation depend on the expression of intrapyramidal CA, identified as the CA isoform VII. Studies on mice with targeted Slc4a10 gene disruption revealed an important role for NCBE in neuronal pH regulation and in pH-dependent modulation of neuronal excitability. Furthermore, this ion transporter is involved in the basolateral Na+ and HCO3- uptake in choroid plexus epithelial cells, and is thus likely to contribute to cerebrospinal fluid production.

Väitöskirjassani tarkastelen hermosolujen ionisäätelyyn osallistuvien proteiinien toiminnan merkitystä hermosolujen välisessä kommunikaatiossa. Tutkimuksellinen painopiste kohdistuu kloridi-, protoni- ja bikarbonaatti-ioneihin sekä niiden säätelyyn osallistuvien solukalvon ionikuljettajiin ja hiilidioksidi-bikarbonaatti tasapainon säätelyyn osallistuvaan soluliman karboanhydraasi-entsyymiin. Tutkimuksessa on tarkasteltu näiden ionisäätelyproteiinien ilmentymistä yksilönkehityksen aikana, niiden vaikutusta hermosolujen ja hermosoluverkkojen synaptiseen ja ei-synaptiseen kommunikaatioon sekä kyseisten signalointimekanismien biofysikaalisia mekanismeja. Gamma-aminovoihappo (GABA) on täysikasvuisen nisäkkään aivojen pääasiallinen hermoimpulsseja ehkäisevä välittäjäaine. Siihen pohjautuva hermosolujen välinen nopea viestintä perustuu ns. A-tyypin GABA kanavien läpi kulkeviin kloridi- ja bikarbonaatti-ionien kantamiin sähkövirtoihin. Näiden ionien solunsisäisiä pitoisuuksia säätelevät proteiinit muovaavat GABA-välitteistä hermosoluviestintää. Väitöskirjassani esitetyt tutkimustulokset osoittavat, että tietyn kaliumvaraisen kloridikuljettajan (KCC2:n) ilmentyminen kehittyvissä aivoissa on edellytys hermoimpulsseja ehkäisevien, GABAA-kanavien kautta solusta ulos suuntautuvien virtojen synnylle. Myöhemmässä kehitysvaiheessa GABAA-kanavien voimakas aktivoituminen voi, esimerkiksi patofysiologisissa tilanteissa, johtaa solunsisäisen ja -ulkoisen ionitasapainon tilapäiseen häiriintymiseen, jolloin GABAA-kanavien tuottamat vasteet paradoksaalisesti synnyttävät hermoimpulsseja. Tällainen GABAA-välitteinen hermoärsytys edellyttää bikarbonaatti-ionien nopeaa tuottoa solunsisäisen karboanhydraasi-entsyymin avulla, mikä johtaa hermosoluja ärsyttävään hetkelliseen soluvälitilan kalium-pitoisuuden kasvuun. Tutkimukseni perusteella voidaan todeta, että karboanhydraasi-entsyymin ilmentyminen rotan hippokampus-aivoalueen pyramidihermosoluissa lisääntyy vasta syntymänjälkeisen kehityksen aikana ja on ratkaiseva tekijä tämän aivoalueen hermoverkon ärtyvyyden kasvussa. Lisäksi tutkin geenin Slc4a10 koodaamaa, natriumista riippuvaista bikarbonaatti-kuljettajaa (NCBE). Tulosten mukaan NCBE:lla on tärkeä osuus hippokampuksen pyramidisolujen pH-, ja sitä kautta myös ärtyvyyden, säätelyssä: poistogeenisten NCBE-hiirten hippokampuksen pyramidisolujen kyky poistaa protoni-ylijäämää oli selvästi heikentynyt ja vastaavasti kynnys epileptisen kohtauksen laukeamiselle oli huomattavasti kohonnut. Tutkimustulokset viittaavat pH-säätelymekanismien tärkeään rooliin hermosolujen ärtyvyyden kontrolloinnissa. On myös erittäin todennäköistä, että poistogeenisissä NCBE-hiirissä havaittu aivokammioiden tilavuuden radikaali pienentyminen on seurausta aivo-selkäydinnesteen tuotannon heikentymisestä. Havainnot tukevat ajatusta, että NCBE kuljettajaproteiinista riippuvaisella natriumin ja bikarbonaatin yhteiskuljetuksella aivojen suonipunosten epiteelisoluissa olisi merkittävä osuus aivo-selkäydinnesteen tuotannossa.