Regulation of Osteoblast Differentiation and Gene Expression by Phosphodiesterases and Bioactive Peptides

Bone is a mineralized tissue that enables multiple mechanical and metabolic functions to be carried out in the skeleton. Bone contains distinct cell types: osteoblasts (bone-forming cells), osteocytes (mature osteoblast that embedded in mineralized bone matrix) and the osteoclasts (bone-resorbing cells). Remodelling of bone begins early in foetal life, and once the skeleton is fully formed in young adults, almost all of the metabolic activity is in this form. Bone is constantly destroyed or resorbed by osteoclasts and then replaced by osteoblasts. Many bone diseases, i.e. osteoporosis, also known as bone loss, typically reflect an imbalance in skeletal turnover. The cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and the cyclic guanosine monophosphate (cGMP) are second messengers involved in a variety of cellular responses to such extracellular agents as hormones and neurotransmitters. In the hormonal regulation of bone metabolism, i.e. via parathyroid hormone (PTH), parathyroid hormone-related peptide (PTHrp) and prostaglandin E2 signal via cAMP. cAMP and cGMP are formed by adenylate and guanylate cyclases and are degraded by phosphodiesterases (PDEs). PDEs determine the amplitudes of cyclic nucleotide-mediated hormonal responses and modulate the duration of the signal. The activities of the PDEs are regulated by multiple inputs from other signalling systems and are crucial points of cross-talk between the pathways. Food-derived bioactive peptides are reported to express a variety of functions in vivo. The angiotensin-converting enzymes (ACEs) are involved in the regulation of the specific maturation or degradation of a number of mammalian bioactive peptides. The bioactive peptides offer also a nutriceutical and a nutrigenomic aspect to bone cell biology. The aim of this study was to investigate the influence of PDEs and bioactive peptides on the activation and the differentiation of human osteoblast cells. The profile of PDEs in human osteoblast-like cells and the effect of glucocorticoids on the function of cAMP PDEs, were investigated at the mRNA and enzyme levels. The effects of PDEs on bone formation and osteoblast gene expression were determined with chemical inhibitors and siRNAs (short interfering RNAs). The influence of bioactive peptides on osteoblast gene expression and proliferation was studied at the mRNA and cellular levels. This work provides information on how PDEs are involved in the function and the differentiation of osteoblasts. The findings illustrate that gene-specific silencing with an RNA interference (RNAi) method is useful in inhibiting, the gene expression of specific PDEs and further, PDE7 inhibition upregulates several osteogenic genes and increases bALP activity and mineralization in human mesenchymal stem cells-derived osteoblasts. PDEs appear to be involved in a mechanism by which glucocorticoids affect cAMP signaling. This may provide a potential route in the formation of glucocorticoid-induced bone loss, involving the down-regulation of cAMP-PDE. PDEs may play an important role in the regulation of osteoblastic differentiation. Isoleucine-proline-proline (IPP), a bioactive peptide, possesses the potential to increase osteoblast proliferation, differentiation and signalling.

Monet luusairaudet, kuten osteoporoosi, johtuvat epätasapainosta luun uusiutumiskierrossa. Luusairauksien ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi on tärkeää ymmärtää niitä tekijöitä, jotka säätelevät luukudoksen aineenvaihduntaa ja fysiologiaa. Osteoblastit ovat luuston soluja, jotka vastaavat luunmuodostuksesta. Solujen toimintaa ohjaavat solun sisäiset ja ulkoiset signaalit, jotka voivat tehostaa tai heikentää solun jakautumista, erilaistumista ja elinikää. Osteoblastien lukumäärä ja aktiivisuus vaikuttavat luukudoksen määrään ja laatuun, jolla on iso merkitys luun kestävyyteen ja murtuma-alttiuteen. Väitöskirjatyön osatöissä I-III tutkittiin luutamuodostavien solujen signaalivälitystä, toimintaa ja erilaistumista in vitro. Syklinen AMP (cAMP) on tärkeä luun aineenvaihduntaa säätelevä toisiolähetti mm. kilpirauhashormonin vaikutukset välittyvät sen kautta. Fosfodiesteraasit (PDE:t) ovat entsyymejä, jotka inaktivoivat cAMP:in. PDE perheitä on 11 ja niiden luustovaikutukset saattavat vaihdella. Väitöskirjatyössä kartoitettiin ihmisen luuta muodostavien solujen PDEiden ilmenemistä, selvitettiin PDE7 ja PDE8 geenien hiljentämisen luusoluvaikutuksia ja tutkittiin synteettisen glukokortikoidin vaikutusta osteoblastien cAMP:hen, fosfodiesteraasigeenien ilmenemiseen ja aktiivisuuteen. Osatyössä IV tutkittiin kolmen bioaktiivisen peptidin IPP, LKP ja VPP lyhytaikaisvaikutusta osteoblastien geenien ilmenemiseen ja solujen jakautumiseen. Proteiinien peptidit toimivat elimistön rakennusaineena, mutta ohjaavat myös solujen toimintaa. Vaikka PDE:t ovat tärkeä osa solun signaalivälitystä, niista tiedetään hyvin vähän luusoluissa. Fosfodiesteraasi-estäjistä on tullut tärkeitä terapeuttisia aineita monen sairauden, kuten sydämen vajaatoiminnan, masennuksen, astman ja impotenssin hoidossa. Tunnetuin fosfodiesteraasi-estäjistä lienee sildenafiilisitraatti (Viagra®). Väitöskirjatyö valaiseen osteoblastien fosfodiestraasientsyymien ilmenemistä ja estämisen seurauksia luuta muodostaviin soluihin. PDE7:n toiminnan estäminen lisää osteoblastien erilaistumista ja mineraalin muodostamista. Deksametasoni, kortisonijohdos vähentää PDE4:n entsyymi-aktiivisuutta luuta muodostavissa soluissa. Glukokortikoideja käytetään hillitsemään tulehdusreaktioita ja niiden pitkäaikaiskäytöllä on havaittu luustovaikutuksia. Luustoa heikentävä vaikutus saattaa osin välittyä PDE4:n toiminnan estämisen kautta. Fosfodiesteraasientsyymien aktiivisuuden hallittu ja kohdennettu säätely tarjoaa mahdollisuuden tehostaa osteoblastien erilaistumista ja toimintaa ja siten uuden luun muodostusta. IPP, yksi tutkituista bioaktiivisista peptideistä, lisäsi osteoblastisolujen jakautumista, ja erilaistumiseen, signaloitumiseen ja elinkykyyn vaikuttavien geenien ilmenemistä. Bioaktiivisten peptidien luusoluvaikutukset saattavat lisätä kiinnostusta funktionaalisia ja luustoaktiivisia peptidejä sisältävien ravintoaineiden kehittämiseen.