Structure and function of GDNF receptor alpha splice variants

The growth factors of the glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) family consisting of GDNF, neurturin (NRTN), artemin (ARTN) and persephin (PSPN), are involved in the development, differentiation and maintenance of many types of neurons. They also have important functions outside the nervous system in the development of kidney, testis and thyroid gland. Each of these GFLs preferentially binds to one of the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored GDNF family receptors α (GFRα). GDNF binds to GFRα1, NRTN to GFRα2, ARTN to GFRα3 and PSPN to GFRα4. The GFLs in the complex with their cognate GFRα receptors all bind to and signal through the receptor tyrosine kinase RET. Alternative splicing of the mouse GFRα4 gene yields three splice isoforms. These had been described as putative GPI-anchored, transmembrane and soluble forms. My goal was to characterise the function of the different forms of mouse GFRα4. I firstly found that the putative GPI-anchored GFRα4 (GFRα4-GPI) is glycosylated, membrane-bound, GPI-anchored and interacts with PSPN and RET. We also showed that mouse GFRα4-GPI mediates PSPN-induced phosphorylation of RET, promotes PSPN-dependent neuronal differentiation of the rat pheochromocytoma cell line PC6-3 and PSPN-dependent survival of cerebellar granule neurons (CGN). However, although this receptor can mediate PSPN-signalling and activate RET, GFRα4-GPI does not recruit RET into lipid rafts. The recruitment of RET into lipid rafts has previously been thought to be a crucial event for GDNF- and GFL-mediated signalling via RET. I secondly demonstrated that the putative transmembrane GFRα4 (GFRα4-TM) is indeed a real transmembrane GFRα4 protein. Although it has a weak binding capacity for PSPN, it can not mediate PSPN-dependent phosphorylation of RET, neuronal differentiation or survival. These data show that GFRα4-TM is inactive as a receptor for PSPN. Surprisingly, GFRα4-TM can negatively regulate PSPN-mediated signalling via GFRα4-GPI. GFRα4-TM interacts with GFRα4-GPI and blocks PSPN-induced phosphorylation of RET, neuronal differentiation as well as survival. Taken together, our data show that GFRα4-TM may act as a dominant negative inhibitor of PSPN-mediated signaling. The most exciting part of my work was the finding that the putative soluble GFRα4 (GFRα4-sol) can form homodimers and function as an agonist of the RET receptor. In the absence of PSPN, GFRα4-sol can promote the phosphorylation of RET, trigger the activation of the PI-3K/AKT pathway, induce neuronal differentiation and support the survival of CGN. Our findings are in line with a recent publication showing the GFRα4-sol might contribute to the inherited cancer syndrome multiple endocrine neoplasia type 2. Our data provide an explanation to how GFRα4-sol may cause or modify the disease. Mammalian GFRα4 receptors all lack the first Cys-rich domain which is present in other GFRα receptors. In the final part of my work I have studied the function of this particular domain. I created a truncated GFRα1 construct lacking the first Cys-rich domain. Using binding assays in both cellular and cell-free systems, phosphorylation assays with RET, as well as neurite outgrowth assays, we found that the first Cys-rich domain contributes to an optimal function of GFRα1, by stabilizing the interaction between GDNF and GFRα1.

GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) -perheen hermokasvutekijät GDNF, neurturiini (NRTN), artemiini (ARTN) ja persefiini (PSPN) osallistuvat useiden hermosolutyyppien kehittymiseen, erilaistumiseen ja ylläpitoon. Niillä on myös tärkeitä toimintoja hermoston ulkopuolella munuaisen, testiksen sekä kilpirauhasen kehityksessä. Kukin näistä GFL:istä (GDNF family ligand) sitoutuu ensisijaisesti yhteen glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) -ankkuroituun GFRα (GDNF family receptor α) -reseptoriin: GDNF sitoutuu GFRα1:een, NRTN GFRα2:een, ARTN GFRα3:een ja PSPN GFRα4:een. Jokainen GFL sitoutuu yhdessä siihen kuuluvan GFRα-reseptorin kanssa reseptorityrosiinikinaasi RET:iin ja signaloi sen kautta. Hiiren GFRα4-geenin vaihtoehtoisen silmikoinnin tuloksena on oletettu syntyvän kolmenlaisia GFRα4-reseptoreja - GPI-ankkuroituja, solukalvon lävistäviä sekä liukoisia. Havaitsin ensin, että mahdollinen GPI-ankkuroitu GFRα4 (GFRα4-GPI) on glykosyloitu sekä todella sitoutunut solukalvoon GPI-ankkurilla ja interaktoi PSPN:n sekä RET:n kanssa. Osoitimme myös, että hiiren GFRα4-GPI välittää PSPN:n indusoimaa RET:n fosforylaatiota ja edistää PSPN:stä riippuvaa rotan feokromosytoomaperäisen PC6-3-solulinjan solujen erilaistumista neuronaalisiksi sekä CGN (cerebellar granule neuron) -solujen PSPN:stä riippuvaa eloonjäämistä. Vaikka tämä reseptori pystyy välittämään PSPN:n signalointia ja aktivoimaan RET:n, GFRα4-GPI ei kuitenkaan vedä RET:ä mukanaan solukalvon lipidilautoille. Tämän tapahtuman on aikaisemmin oletettu olevan ratkaisevassa asemassa GDNF- ja GFL-välitteisessä RET-signaloinnissa. Seuraavaksi osoitin, että mahdollinen transmembraani-GFRα4 (GFRα4-TM) on todella solukalvon läpäisevä GFRα4-proteiini. Vaikka se sitoo heikosti PSPN:ä, se ei kuitenkaan pysty välittämään PSPN:stä riippuvaa RET:n fosforylaatiota, neuronaalista erilaistumista tai eloonjäämistä. Tämä aineisto osoittaa, että GFRα4-TM on PSPN-reseptorina inaktiivinen. Yllättäen GFRα4-TM pystyy kuitenkin säätelemään negatiivisesti PSPN:stä riippuvaa GFRα4-GPI:n kautta tapahtuvaa signalointia. GFRα4-TM interaktoi GFRα4-GPI:n kanssa ja estää PSPN:stä riippuvan RET-fosforylaation, neuronaalisen erilaistumisen sekä eloonjäämisen. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että GFRα4-TM saattaa toimia dominant negative -tyyppisenä inhibiittorina PSPN-välitteiselle signaloinnille. Mielenkiintoisin osa työstäni oli havainto, että mahdollinen liukoinen GFRα4 (GFRα4-sol) voi muodostaa homodimeerejä ja toimia RET-reseptorin agonistina. Ilman PSPN:ä GFRα4-sol pystyy edistämään RET:n fosforylaatiota, laukaisemaan PI-3K/AKT-reitin aktivaation, indusoimaan neuronaalista erilaistumista sekä tukemaan CGN-solujen eloonjäämistä. Löydöksemme sopivat hyvin yhteen vastikään julkaistujen tulosten kanssa, jotka osoittavat, että GFRα4-sol saattaa edesauttaa perinnöllisen syöpäsyndrooman, multippelin endokriinisen neoplasia tyyppi 2:n, puhkeamista. Tuloksemme antavat selityksen sille, miten GFRα4-sol voi aiheuttaa tai muunnella tätä sairautta. Kaikkien nisäkkäiden GFRα4-reseptoreista puuttuu ensimmäinen Cys-pitoinen domeeni, joka on muissa GFRα-reseptoreissa. Työni viimeisessä osassa tutkin tämän domeenin toimintaa. Tein GFRα1-konstruktin, jota oli lyhennetty niin, että siitä puuttui ensimmäinen Cys-pitoinen domeeni. Käyttäen sitomiskokeita sekä solupohjaisissa että soluttomissa systeemeissä, RET:n fosforylaatiokokeita, sekä neuriittien uloskasvukokeita havaitsimme, että tämä ensimmäinen Cys-pitoinen domeeni edesauttaa GFRα1-reseptorin optimaalista toimintaa stabiloimalla GDNF:n ja GFRα1:n välistä interaktiota.