Multifunctional RNA silencing pathway polymerase QDE-1 of Neurospora crassa

Double-stranded RNA and associated proteins are known to regulate the gene expression of most eukaryotic organisms. These regulation pathways have different components, outcomes and distinct nomenclature depending on the model system, and often they are referred to collectively as RNA silencing. In many cases, RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) are found to be involved in the RNA silencing, but their targets, activities, interaction partners and reaction products remain enigmatic. In the filamentous fungus Neurospora crassa, the RdRP QDE-1 is critical for silencing of transgenes a phenomenon known as quelling. In this thesis the structure, biochemical activities and biological functions of QDE-1 were extensively studied. This dimeric RdRP was shown to possess five distinct catalytic in vitro activities that could be dissected by mutagenesis and by altering reaction conditions. The biochemical characterization implied that QDE-1 is actually an active DNA-dependent RNA polymerase that has additional RdRP activity. It also provided a structural explanation for the dimerization and suggested a biological framework for the functions of QDE-1 in vivo. (I) QDE-1 was also studied in a broader context along with the other components of the quelling pathway. It was shown that DNA damage in Neurospora causes a dramatic increase in the expression level of the Argonaute protein QDE-2 as well as the synthesis of a novel class of small RNAs known as qiRNAs. The accumulation of qiRNAs was shown to be dependent on several quelling components, and particularly to be derived from an aberrant ssRNA (aRNA) molecule that is synthesized by QDE-1 in the nucleus. The genomic distribution of qiRNA targets was analyzed and the possible biological significance of qiRNAs was studied. Importantly, qiRNAs are the first class of small RNAs that are induced by DNA damage. (II) After establishing that QDE-1 is a multifunctional RNA polymerase with several activities, template specificities and subcellular locations, the focus was turned onto its interaction partners. It had been previously known that QDE-1 associates with Replication Protein A (RPA), but the RecQ helicase QDE-3 was now shown to regulate this interaction. RPA was also observed to promote QDE-1 dependent dsRNA synthesis in vitro. By characterizing the interplay between QDE-1, QDE-3 and RPA, a working model of quelling and qiRNA pathways in Neurospora was presented. (III) This work sheds light on the complexity of the various RNA silencing pathways of a fungal model system. It shows how an RdRP can regulate gene expression on many levels, and suggests novel lines of research in other eukaryotic organisms.

Solun normaali toiminta perustuu erilaisten proteiinimolekyylien oikeaan määrään, rakenteeseen sekä aktiivisuuteen. Geenit sisältävät ohjeet proteiinien synteesiin, mutta geenien ilmentymistä säätelee valtavan monimutkainen ja yhä laajalti tuntematon biokemiallinen verkosto. Vasta hiljattain on ymmärretty, että erilaiset RNA-molekyylit ohjaavat geenien ilmentymistä useimmissa eliöissä. Etenkin kaksijuosteisen RNA:n on havaittu säätelevän toisten RNA-molekyylien määrää ja aktiivisuutta hyvinkin täsmällisesti. Ilmiötä kutsutaan RNA-tason geneettiseksi hiljentämiseksi, ja se on erittäin hyvin säilynyt aitotumallisten eliöiden evoluutiossa. -- Tässä työssä tutkitaan Neurospora crassa sienestä eristettyä QDE-1 proteiinia, joka on RNA:ta templaattinaan käyttävä RNA-polymeraasi (RdRP). QDE-1 on tärkeässä asemassa siirtogeenisten sekä hyppivien elementtien vaimentamisessa. On ajateltu, että QDE-1 tunnistaa siirtogeenisistä alueista peräisin olevat RNA-molekyylit ja muuttaa ne kaksijuosteiseksi RNA:ksi. Tämä kaksijuosteinen RNA prosessoidaan pienemmiksi siRNA-molekyyleiksi, jotka puolestaan ohjaavat siirtogeenisten RNA-molekyylien hajotusta. Väitöskirjassa osoitetaan, että QDE-1:lla on aikaisemmin tunnettujen ominaisuuksien lisäksi monia muita katalyyttisia aktiivisuuksia. Näistä tärkein on DNA:sta riippuvainen RNA-polymeraasiaktiivisuus (DdRP), joka osoittautui aiemmin tunnettua RdRP-aktiivisuutta paljon merkittävämmäksi. Lisäksi havaittiin, että QDE-1 aktivoituu solun DNA:n vaurioituessa ja että tämä aktivoituminen johtaa uudentyyppisten pienten RNA-molekyylien (qiRNA) synteesiin. Edelleen osoitettiin, että QDE-1 muodostaa kompleksin kahden muun proteiinin (QDE-3, RPA) kanssa, mikä muokkaa QDE-1:n toimintaa. Väitöskirjassa esitetyt tulokset uudistavat käsitystämme Neurospora crassa sienen geenien ilmentymisen säätelystä. Uuden, väitöskirjassa esitetyn mallin mukaan QDE-1 on aktiivinen soluliman lisäksi myös tumassa. Se voi käyttää templaattinaan sekä DNA:ta että RNA:ta, ja DNA:n vaurioituminen johtaa uudentyyppiseen biokemialliseen vasteeseen. Näillä tuloksilla on merkitystä myös laajemmin, sillä samankaltaisia RNA-polymeraaseja on löydetty miltei kaikista tutkituista aitotumallisista eliöistä. Vastaavat säätelymekanismit saattavat siis vallita myös kasveissa ja eläimissä.