Mechanisms and molecular regulation of mammalian tooth replacement

In most non-mammalian vertebrates, such as fish and reptiles, teeth are replaced continuously. However, tooth replacement in most mammals, including human, takes place only once and further renewal is apparently inhibited. It is not known how tooth replacement is genetically regulated, and little is known on the physiological mechanism and evolutionary reduction of tooth replacement in mammals. In this study I have attempted to address these questions. In a rare human condition cleidocranial dysplasia, caused by a mutation in a Runt domain transcription factor Runx2, tooth replacement is continued. Runx2 mutant mice were used to investigate the molecular mechanisms of Runx2 function. Microarray analysis from dissected embryonic day 14 Runx2 mutant and wild type dental mesenchymes revealed many downstream targets of Runx2, which were validated using in situ hybridization and tissue culture methods. Wnt signaling inhibitor Dkk1 was identified as a candidate target, and in tissue culture conditions it was shown that Dkk1 is induced by FGF4 and this induction is Runx2 dependent. These experiments demonstrated a connection between Runx2, FGF and Wnt signaling in tooth development and possibly also in tooth replacement. The role of Wnt signaling in tooth replacement was further investigated by using a transgenic mouse model where Wnt signaling mediator β-catenin is continuously stabilized in dental epithelium. This stabilization led to activated Wnt signaling and to the formation of multiple enamel knots. In vitro and transplantation experiments were performed to examine the process of extra tooth formation. We showed that new teeth were continuously generated and that new teeth form from pre-existing teeth. A morphodynamic activator-inhibitor model was used to simulate enamel knot formation. By increasing the intrinsic production rate of the activator (β-catenin), the multiple enamel knot phenotype was reproduced by computer simulations. It was thus concluded that β-catenin acts as an upstream activator of enamel knots, closely linking Wnt signaling to the regulation of tooth renewal. As mice do not normally replace teeth, we used other model animals to investigate the physiological and genetic mechanisms of tooth replacement. Sorex araneus, the common shrew was earlier reported to have non-functional tooth replacement in all antemolar tooth positions. We showed by histological and gene expression studies that there is tooth replacement only in one position, the premolar 4 and that the deciduous tooth is diminished in size and disappears during embryogenesis without becoming functional. The growth rates of deciduous and permanent premolar 4 were measured and it was shown by competence inference that the early initiation of the replacement tooth in relation to the developmental stage of the deciduous tooth led to the inhibition of deciduous tooth morphogenesis. It was concluded that the evolutionary loss of deciduous teeth may involve the early activation of replacement teeth, which in turn suppress their predecessors. Mustela putorius furo, the ferret, has a dentition that resembles that of the human as ferrets have teeth that belong to all four tooth families, and all the antemolar teeth are replaced once. To investigate the replacement mechanism, histological serial sections from different embryonic stages were analyzed. It was noticed that tooth replacement is a process which involves the growth and detachment of the dental lamina from the lingual cervical loop of the deciduous tooth. Detachment of the deciduous tooth leads to a free successional dental lamina, which grows deeper into the mesenchyme, and later buds the replacement tooth. A careful 3D analysis of serial histological sections was performed and it was shown that replacement teeth are initiated from the successional dental lamina and not from the epithelium of the deciduous tooth. The molecular regulation of tooth replacement was studied and it was shown by examination of expression patterns of candidate regulatory genes that BMP/Wnt inhibitor Sostdc1 was strongly expressed in the buccal aspect of the dental lamina, and in the intersection between the detaching deciduous tooth and the successional dental lamina, suggesting a role for Sostdc1 in the process of detachment. Shh was expressed in the enamel knot and in the inner enamel epithelium in both generations of teeth supporting the view that the morphogenesis of both generations of teeth is regulated by similar mechanisms. In summary, histological and molecular studies on different model animals and transgenic mouse models were used to investigate tooth replacement. This thesis work has significantly contributed to the knowledge on the physiological mechanisms and molecular regulation of tooth replacement and its evolutionary suppression in mammals.

Monilla alemmilla selkärankaisilla, kuten kaloilla ja liskoilla, hampaat uusiutuvat läpi elämän ja uusia hampaita kasvaa pudonneiden ja vioittuneiden hampaiden tilalle sekä leuan kasvaessa. Nisäkkäillä, kuten ihmisellä, hampaiden jatkuva uusiutuminen on kuitenkin estetty ja useimmilla nisäkkäillä kehittyy vain kahdet hampaat, primääriset maitohampaat ja sekundääriset pysyvät hampaat. Ei tiedetä kuinka hampaiden uusiutuminen on geneettisesti säädeltyä ja myös pysyvien hampaiden kehityksen histologinen mekanismi tunnetaan huonosti. Syitä hampaiden uusiutumisen vähenemiseen evoluutiossa ei tiedetä. Väitöskirjassani olen yrittänyt löytää vastauksia näihin kysymyksiin. On olemassa syndrooma, kleidokraniaalinen dysplasia, jossa potilaiden hampaiden uusiutuminen jatkuu. Tämän syndrooman aiheuttaa mutaatio Runx2 geenissä. Käyttämällä Runx2 muuntogeenistä hiirtä, kudosviljely ja in situ hybridisaatio tekniikoita tutkin Runx2 geenin säätelemiä geenejä. Osoitin, että Wnt signaalipolun estäjä Dickkopf1 geenin ilmentyminen puuttui kokonaan Runx2 muuntogeenisen hiiren kehittyvän hampaan aiheessa. Kudosviljelyolosuhteissa osoitin, että FGF4 proteiini indusoi Dickkopp1 geeniä hampaan mesenkyymikudoksessa ja tämä ilmentyminen oli Runx2 geenistä riippuvainen. Nämä kokeet osoittivat, että Runx2, FGF ja Wnt signaalipolut toimivat ainakin osittain yhdessä hampaan kehityksen aikana. Koska Runx2 geeni vaikuttaa myös primäärihampaiden kehityksen säätelyyn ja homotsygootilla muuntogeenisellä hiirellä primäärihampaiden kehitys pysähtyy jo varhaisessa lakki vaiheessa eikä uusia hampaita pääse syntymään, en pystynyt tällä hiiri mallilla tutkimaan hampaiden uusiutumisen mekanismia. Pohdin, että nämä samat signaalimekanismit, FGF ja Wnt, voivat säädellä myös pysyvien hampaiden kehitystä yhdessä Runx2 geenin kanssa. Täten halusin tutkia tarkemmin Wnt signaalipolkua hampaan uusiutumisessa. Myös aikaisempien tutkimustulosten perusteella Wnt signaalipolun on osoitettu liittyvän hampaiden uusiutumiseen. On osoitettu, että Axin2 geenin mutaatio ihmisillä aiheuttaa hampaiden puutosta erityisesti pysyvissä hampaissa. Axin2 on Wnt signaalipolkuun kuuluva estäjä, jonka omaa pitoisuutta solussa Wnt signaalipolku myös säätelee. Tutkimuksessani käytin hiirimallia, missä Wnt signaalipolun välittäjä Beta-kateniini on jatkuvasti aktiivinen hiiren kehittyvän hampaan epiteelikudoksessa. Lisäämällä Beta-kateniini geenin aktiivisuutta hiiren hampaan epiteelikudoksessa, Wnt signaalipolku stimuloitui ja tämä johti hampaiden jatkuvaan uusiutumiseen. Tämä tulos osoitti, että olen löytänyt hampaiden uusiutumista säätelevän geenin, jonka aktiivisuutta lisäämällä sain nisäkkäillä aikaan hampaiden jatkuvaa uusiutumista. Lisäksi näiden muuntogeenisten hampaiden muoto muistutti kalojen tai liskojen yksinkertaisia kartiomaisia hampaita. Tämä viittaa siihen, että Beta-kateniini geenillä on ollut mahdollisesti rooli myös hampaiden muodon kehityksessä monimutkaisemmaksi, nisäkkäiden moninystermäisiksi hampaiksi, samalla kun hampaiden uusiutuminen evoluutiossa väheni. Koska hiiret eivät normaalisti uusi hampaitaan, yritin löytää mallieläimen jolla pysyvien hampaiden kehityksen morfologista ja molekulaarista kehitystä voisi tutkia. Käytin mallieläimenä metsäpäästäistä (Sorex araneus). Aikaisemmin on osoitettu, että metsäpäästäiselle kehittyy kaksi hampaistoa, joista kuitenkaan maitohampaat eivät koskaan puhkea, vaan häviävät yksilönkehityksen aikana. Histologisilla leikkeillä, mittausmenetelmillä ja in situ hybridisaatio tekniikoilla osoitin, että vain yhdessä kohtaa hammasrivistöä tapahtui hampaiden uusiutumista. Osoitin, että maitohampaan kehitys pysähtyi varhaisessa vaiheessa ja se hävisi yksilönkehityksen aikana ennen syntymää. Mittasin maito- ja pysyvän hampaan kasvunopeudet ja osoitin, että päästäisen pysyvä hammas alkaa kehittyä niin varhaisessa vaiheessa, että se estää maitohampaan kasvun. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hampaiden evolutiiviseen häviämiseen liittyy pysyvien hampaiden kehityksen varhainen aktivaatio, joka estää sitä edeltävän maitohampaan kehityksen. Koska päästäisellä vain pysyvät hampaat puhkeavat ja vain yhden hampaan kohdalla tapahtui uusiutumista, halusin löytää mallieläimen jolla myös maitohampaat puhkeavat ja ovat toimivat, ja jonka hampaisto muistuttaisi enemmän ihmisen hampaistoa. Hilleri (Mustela putorius furo) osoittautui sopivaksi mallieläimeksi. Hillerillä kehittyvät sekä maitohampaat että pysyvät hampaat ja hampaiden lukumäärä on lähes sama kuin ihmisellä. Histologisien leikkeiden, in situ hybridisaatio tekniikoiden ja 3D mallien avulla tutkin hillerin hampaiden kehitystä. Huomasin, että pysyvien hampaiden kehitys on tapahtuma, jossa hammaslamina on ajallisesti vain väliaikaisesta osa primäärihammasta ja hampaan uusiutumisen aikana hammaslamina kasvaa ja eroaa maitohampaan kielenpuoleisesta epiteelistä. Hammaslaminan irtoaminen maitohampaasta johtaa vapaaseen hammaslaminaan, joka kasvaa syvemmälle mesenkyymikudokseen ja myöhemmin aktivoituu silmikoimaan pysyvän hampaan. 3D analyysin avulla osoitin, että pysyvät hampaat kehittyvät hammaslaminasta eivätkä maitohampaan epiteelistä. Tutkin myös pysyvien hampaiden kehityksen molekulaarista säätelyä ja geenien ilmentymiskuvioita. Osoitin, että Wnt/BMP signaalipolkujen estäjä molekyyli Sostdc1 ilmentyi voimakkaasti juuri irtoavan hammaslaminan ja maitohampaan välissä, sekä hammaslaminan poskenpuoleisellla reunalla, viitaten siihen että Sostdc1 geeni vaikuttaa mahdollisesti hammaslaminan irtoamiseen primäärihampaasta ja täten sillä olisi keskeinen rooli pysyvien hampaiden kehityksessä. Shh geeni ilmentyi myös pysyvien hampaiden signaalikeskuksessa ja sisäepiteelissä, viitaten siihen, että sekä maito-, että pysyvien hampaiden morphogeneesiä säädellään samanlaisin mekanismein. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hammaslamina on hampaiden uusiutumisen säätelyssä avainkudos, jota aktivoimalla mahdollistetaan uusien hampaiden kehitys. Tämä väitöskirja on tuonut huomattavasti uutta tietoa hampaiden uusiutumisen histologisista ja molekulaarisista säätelymekanismeista sekä hampaiden uusiutumisen vähentymisestä evoluution aikana. Tutkimukseni perusteella voidaan olettaa, että ihmisilläkin näyttäisi säilyneen potentiaali hampaiden jatkuvaan uusiutumiseen. Tätä tietoa voidaan mahdollisesti käyttää tulevaisuudessa lääketieteellisiin sovelluksiin.