Generation and Characterization of the Cation-Chloride Cotransporter KCC2 Hypomorphic Mouse

The cation-Cl- cotransporter (CCC) family comprises of Na+-Cl- cotransporter (NCC), Na+-K+-2Cl- cotransporters (NKCC1-2), and four K+-Cl- cotransporters (KCC1-4). These proteins are involved in several physiological activities, such as cell volume regulation. In neuronal tissues, NKCC1 and KCC2 are important in determining the intracellular Cl- levels and hence the neuronal responses to inhibitory neurotransmitters GABA and glycine. One aim of the work was to elucidate the roles for CCC isoforms in the control of nervous system development. KCC2 mRNA was shown to be developmentally up-regulated and follow neuronal maturation, whereas NKCC1 and KCC4 transcripts were highly expressed in the proliferative zones of subcortical regions. KCC1 and KCC3 mRNA displayed low expression throughout the embryogenesis. These expression profiles suggest a role for CCC isoforms in maturation of synaptic responses and in the regulation of neuronal proliferation during embryogenesis. The major aim of this work was to study the biological consequences of KCC2-deficiency in the adult CNS, by generating transgenic mice retaining 15-20% of normal KCC2 levels. In addition, by using these mice as a tool for in vivo pharmacological analysis, we investigated the requirements for KCC2 in tonic versus phasic GABAA receptor-mediated inhibition. KCC2-deficient mice displayed normal reproduction and life span, but showed several behavioral abnormalities, including increased anxiety-like behavior, impaired performance in water maze, alterations in nociceptive processing, and increased seizure susceptibility. In contrast, the mice displayed apparently normal spontaneous locomotor activity and motor coordination. Pharmacological analysis of KCC2-deficient mice revealed reduced sensititivity to diazepam, but normal gaboxadol-induced sedation, neurosteroid hypnosis and alcohol-induced motor impairment. Electrophysiological recordings from CA1-CA3 subregions of the hippocampus showed that KCC2 deficiency affected the reversal potentials of both the phasic and tonic GABA currents, and that the tonic conductance was not affected. The results suggest that requirement for KCC2 in GABAergic neurotransmission may differ among several functional systems in the CNS, which is possibly due to the more critical role of KCC2 activity in phasic compared to tonic GABAergic inhibition.

Kationi-kloridi kuljetusproteiini-perhe koostuu natrium-kloridi (NCC), natrium-kalium-kloridi (NKCC1-2), sekä kalium-kloridi (KCC1-4) kuljetusproteiineista. Nämä proteiinit ovat osallisena useissa solujen fysiologissa prosesseissa, kuten solujen tilavuuden säätely. KCC2 ja NKCC1 ovat erityisen tärkeitä hermokudoksessa, jossa ne säätelevät solujen kloridipitoisuutta ja täten hermoston estävien välittäjäaineiden γ-aminovoihapon (GABA) ja glysiinin toimintaa. Yksi työn tavoitteista oli selventää näiden proteiinien rooleja hermoston kehityksessä. KCC2 mRNA:n ilmenemisen havaittiin voimistuvan tuntuvasti kehityksen kuluessa ja seuraavan hermoston kehitystä. NKCC1 ja KCC4 mRNA:t ilmentyivät voimakkaimmin niillä aivojen alueilla, joissa solut jakaantuvat neurogeneesin aikana. KCC1 ja KCC3 mRNA:t ilmentyivät vähäisesti koko sikiönkehityksen ajan. Tulokset puoltavat mahdollista roolia kationi-kloridi kuljetusproteiineille synapsien vasteiden kehityksessä, sekä hermosolujen jakautumisen säätelyssä. Työn päätavoitteena oli tuottaa KCC2-hypomorfinen hiiri (n. 80 % puutos) ja tutkia tämän hiiren ilmiasun muutoksia. Käytimme kyseistä hiirimallia myös selvittääksemme farmakologisesti KCC2:n osuutta GABAA-reseptorikompleksin välittämässä faasisessa ja toonisessa neurotransmissiossa. KCC2:n puutos ilmeni käyttäytymisen tasolla. Hiiri oli ahdistushäiriöinen ja selkeästi normaalia kouristusherkempi, sekä osoitti muistihäiriöitä ja normaalia korkeamman kipukynnyksen. Hiiren motorinen koordinaatio ja spontaani lokomotorinen aktiivisuus olivat sitä vastoin ilmeisen normaalilla tasolla. KCC2-hypomorfisen hiiren farmakologinen analyysi osoitti hiiren olevan epäherkkä bentsodiatsepiini diatsepaamille, mutta normaalisti herkkä gaboksadolin sedaatiovasteelle, neurosteroidin hypnoosivasteelle sekä alkoholin motoriikkaa huonontavalle vasteelle. Sähköfysiologiset mittaukset hippokampuksessa osoittivat KCC2 puutoksen vaikuttavan GABAA-välitteisten faasisten ja toonisten sähkövirtojen käänteispotentiaaleihin, mutta GABAA-välitteinen tooninen konduktanssi oli ilmeisen normaali. Nämä tulokset antavat olettaa että GABA neurotransmissiossa KCC2:n rooli voi vaihdella riippuen siitä, mitä keskushermoston eri funktionaalisista järjestelmistä aktivoidaan. Tämä voi johtua KCC2:n kriittisemmästä roolista GABAA-välitteisessä faasisessa neurotransmissiossa verrattuna tooniseen neurotransmissioon.