Proton translocation coupled to electron transfer reactions in terminal oxidases

Terminal oxidases are the final proteins of the respiratory chain in eukaryotes and some bacteria. They catalyze most of the biological oxygen consumption on Earth done by aerobic organisms. During the catalytic reaction terminal oxidases reduce dioxygen to water and use the energy released in this process to maintain the electrochemical proton gradient by functioning as a redox-driven proton pump. This membrane gradient of protons is extremely important for cells as it is used for many cellular processes, such as transportation of substrates and ATP synthesis. Even though the structures of several terminal oxidases are known, they are not sufficient in themselves to explain the molecular mechanism of proton pumping. In this work we have applied a complex approach using a variety of different techniques to address the properties and the mechanism of proton translocation by the terminal oxidases. The combination of direct measurements of pH changes during catalytic turnover, time-resolved potentiometric electrometry and optical spectroscopy, made it possible to obtain valuable information about various aspects of oxidase functioning. We compared oxygen binding properties of terminal oxidases from the distinct heme-copper (CcO) and cytochrome bd families and found that cytochrome bd has a high affinity for oxygen, which is 3 orders of magnitude higher than that of CcO. Interestingly, the difference between CcO and cytochrome bd is not only in higher affinity of the latter to oxygen, but also in the way that each of these enzymes traps oxygen during catalysis. CcO traps oxygen kinetically - the molecule of bound dioxygen is rapidly reduced before it can dissociate. Alternatively, cytochrome bd employs an alternative mechanism of oxygen trapping - part of the redox energy is invested into tight oxygen binding, and the price paid for this is the lack of proton pumping. A single cycle of oxygen reduction to water is characterized by translocation of four protons across the membrane. Our results make it possible to assign the pumping steps to discrete transitions of the catalytic cycle and indicate that during in vivo turnover of the oxidase these four protons are transferred, one at a time, during the P→F, F→OH, Oh→Eh, and Eh→R transitions. At the same time, each individual proton translocation step in the catalytic cycle is not just a single reaction catalyzed by CcO, but rather a complicated sequence of interdependent electron and proton transfers. We assume that each single proton translocation cycle of CcO is assured by internal proton transfer from the conserved Glu-278 to an as yet unidentified pump site above the hemes. Delivery of a proton to the pump site serves as a driving reaction that forces the proton translocation cycle to continue.

Terminaaliset oksidaasit ovat eukaryoottien ja joidenkin bakteerien hengitysketjujen viimeisiä proteiineja. Ne katalysoivat suurinta osaa aerobisten organismien biologisesta hapenkulutuksesta maapallolla. Katalyyttisen reaktion aikana terminaaliset oksidaasit pelkistävät molekulaarisen hapen vedeksi ja käyttävät prosessissa vapautuneen energian ylläpitääkseen elektrokemiallista protonigradienttia toimimalla protonipumppuina. Tämä protonien muodostama membraanigradientti on äärimmäisen tärkeä soluille, koska sitä käytetään hyväksi monissa solun toiminnoissa kuten substraattien kuljetuksessa ja ATP synteesissä. Vaikka useiden terminaalisten oksidaasien rakenteet tunnetaan, ne eivät itsessään riitä selittämään protonin pumppauksen molekulaarista mekanismia. Tässä työssä olemme käyttäneet monitahoista lähestymistapaa käyttäen erilaisia tekniikoita tutkiaksemme terminaalisten oksidaasien ominaisuuksia ja protonin pumppauksen mekanismia. Katalyyttisen reaktion aikana tapahtuvien pH:n muutosten mittaaminen sekä aikaerotteisen potentiometrisen elektrometrian ja optisen spektroskopian yhdistelmä mahdollisti arvokkaan tiedon keräämisen oksidaasien toiminnan eri osa-alueista. Me kykenimme vertailemaan terminaalisten oksidaasien hapensitomisominaisuuksia hemi-kuparioksidaasi ja bd-oksidaasi entsyymiperheiden välillä ja havaitsimme, että kyseiset proteiinit käyttävät erilaisia mekanismeja hapen sitomisessa. Hemi-kupari oksidaasit sitovat hapen kineettisesti - sitoutunut happimolekyyli pelkistetään nopeasti ennen kuin se ehtii irrota aktiivisesta keskuksesta, kun taas bd-oksidaasi käyttää hapetus-pelkistus energiaa hapen tiukkaan sitomiseen, ja on siten kykenemätön pumppaamaan protoneja. Yhden happimolekyylin pelkistäminen vedeksi mahdollistaa neljän protonin pumppaamisen kalvon yli. Tuloksemme mahdollistavat katalyyttisen kierron eri vaiheiden ja yksittäisten protoninpumppaus tapahtumien yhteen sovittamisen. Jokainen katalyyttisen kierron protonin pumppaus reaktio ei ole vain yksi entsyymin katalysoima reaktio, pikemminkin monimutkainen toisistaan riippuvaisten elektronin ja protonin siirtojen sarja. Oletamme, että jokainen protonin pumppaus reaktio varmistetaan proteiinin sisäisellä protoninsiirto reaktiolla vakioisesta glutamaatti tähteestä vielä tuntemattomaan pumppaus kohtaan . Protonin saapuminen pumppaus kohtaan toimii reaktion liikkeelle panevana voimana, joka pakottaa protonin pumppaus syklin jatkumaan.