ORP2 is a sterol receptor that regulates cellular lipid metabolism

ORP2 is a member of mammalian oxysterol binding protein (OSBP)-related protein/gene family (ORPs), which is found in almost every eukaryotic organism. ORPs have been suggested to participate in the regulation of cellular lipid metabolism, vesicle trafficking and cellular signaling. ORP2 is a cytosolic protein that is ubiquitously expressed and most abundant in the brain. In previous studies employing stable cell lines with constitutive ORP2 overexpression ORP2 was shown to affect cellular cholesterol metabolism. The aim of this study was to characterize the properties and function of ORP2 further. ORP2 ligands were searched for among sterols and phosphoinositides using purified ORP2 and in vitro binding assays. As expected, ORP2 bound several oxysterols and cholesterol, the highest affinity ligand being 22(R)hydroxycholesterol. In addition, affinity for anionic membrane phospholipids, phosphoinositides was observed, which may assist in the membrane targeting of ORP2. Intracellular localization of ORP2 was also investigated. ORP2 was observed on the surface of cytoplasmic lipid droplets, which are storage organelles for neutral lipids. Lipid droplet targeting of ORP2 was inhibited when 22(R)hydroxycholesterol was added to the cells or when the N-terminal FFAT-motif of ORP2 was mutated, suggesting that oxysterols and the N-terminus of ORP2 regulate the localization and the function of ORP2. The role of ORP2 in cellular lipid metabolism was studied using HeLa cell lines that can be induced to overexpress ORP2. Overexpression of ORP2 was shown to enhance cholesterol efflux from the cells resulting in a decreased amount of cellular free cholesterol. ORP2 overexpressing cells responded to the loss of cholesterol by upregulating cholesterol synthesis and uptake. Intriguingly, also cholesterol esterification was increased in ORP2 overexpressing cells. These results may be explained by the ability of ORP2 to bind and thus transport cholesterol, which most likely leads to changes in cholesterol metabolism when ORP2 is overexpressed. ORP2 function was further investigated by silencing the endogenous ORP2 expression with short interfering RNAs (siRNA) in A431 cells. Silencing of ORP2 led to a delayed break-down of triglycerides under lipolytic conditions and an increased amount of cholesteryl esters in the presence of excess triglycerides. Together these results suggest that ORP2 is a sterol-regulated protein that functions on the surface of cytoplasmic lipid droplets to regulate the metabolism of triglycerides and cholesteryl esters. Although the exact mode of ORP2 action still remains unclear, this study serves as a good basis to investigate the molecular mechanisms and possible cell type specific functions of ORP2.

ORP2 on oksisteroleja sitovan proteiinin (OSBP) sukuisen (ORP) proteiini- ja geeniperheen jäsen. ORP:eja löytyy lähes kaikista aitotumallisista organismeista. Näiden proteiinien on havaittu osallistuvan solun rasva-aineenvaihdunnan, vesikkelikuljetuksen ja signaalinvälityksen säätelyyn. Erityisen kiinnostuksen kohteena on ORP:ien rooli sydän- ja verisuonitaudeissa. ORP2 on liukoinen, solunsisäinen proteiini, joka on läsnä kaikissa kudoksissa, runsaimpana kuitenkin aivoissa. Aiemmissa tutkimuksissa on havaittu ORP2:n vaikuttavan solunsisäiseen kolesteroliaineenvaihduntaan Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli selvittää ORP2:n ominaisuuksia ja tehtävää solun rasva-aineenvaihdunnassa. In vitro kokeissa havaitsimme ORP2:n sitovan kolesterolia ja kolesterolin hapettuneita johdannaisia, oksisteroleja. ORP2 sitoi vahvimmin 22(R)hydroksikolesterolia, joka on steroidihormonisynteesin välituote ja säätelee solun kolesteroliaineenvaihduntaa. ORP2 sitoi myös solun kalvoissa esiintyviä fosfolipidejä, fosfoinositideja, joiden arvellaan edistävän ORP2:n sitoutumista solun kalvoihin. Mikroskooppitekniikoilla havaitsimme ORP2:n sijaitsevan solunsisäisten, varastorasvoja sisältävien rasvapisaroiden pinnalla. Kun soluille lisättiin 22(R)hydroksikolesterolia, ORP2 siirtyi pois rasvapisaroiden pinnalta. Myös ORP2:n amino-terminuksessa sijaitsevan FFAT-motiivin mutagenisoiminen aiheutti ORP2:n poistumisen rasvapisaroiden pinnalta, viitaten siihen, että oksisterolit ja ORP2:n amino-terminaalinen osa säätelevät ORP2:n sijaintia solussa ja siten myös sen toimintaa. ORP2:n indusoitava ylituotanto soluviljelmissä lisäsi kolesterolin virtausta ulos solusta johtaen kolesterolin määrän vähenemiseen soluissa. ORP2:a tuottavat solut pyrkivät lisäämään kolesterolin määrää kiihdyttämällä kolesterolin valmistusta ja sisäänottoa. Näiden tulosten arveltiin johtuvan ORP2:n kyvystä sitoa ja mahdollisesti myös kuljettaa kolesterolia, mikä voi johtaa muutoksiin kolesterolin aineenvaihdunnassa, kun ORP2:a tuotetaan soluissa epätavallisen suuria määriä. ORP2:n tuoton estäminen soluviljelmissä pieniä häiritseviä RNA-molekyylejä (siRNA) käyttäen johti triglyseridien hajotuksen viivästymiseen ja kolesteroliesterien määrän lisääntymiseen, kun triglyseridejä oli soluissa runsaasti. Tässä työssä saadut tulokset viittaavat siihen, että ORP2 on sterolien säätelemä proteiini, joka sijaitsee solun rasvapisaroiden pinnalla osallistuen triglyseridien ja kolesteroliesterien aineenvaihduntaan. Näin ollen ORP2:n toimintamekanismin tutkiminen voi tuottaa uutta tietoa, jota voidaan hyödyntää ylipainon, metabolisen oireyhtymän ja sydän- ja verisuonitautien ehkäisyssä.