Theoretical Studies on Coupled Electron and Proton Transfer in Cytochrome c Oxidase

The complexity of life is based on an effective energy transduction machinery, which has evolved during the last 3.5 billion years. In aerobic life, the utilization of the high oxidizing potential of molecular oxygen powers this machinery. Oxygen is safely reduced by a membrane bound enzyme, cytochrome c oxidase (CcO), to produce an electrochemical proton gradient over the mitochondrial or bacterial membrane. This gradient is used for energy-requiring reactions such as synthesis of ATP by F0F1-ATPase and active transport. In this thesis, the molecular mechanism by which CcO couples the oxygen reduction chemistry to proton-pumping has been studied by theoretical computer simulations. By building both classical and quantum mechanical model systems based on the X-ray structure of CcO from Bos taurus, the dynamics and energetics of the system were studied in different intermediate states of the enzyme. As a result of this work, a mechanism was suggested by which CcO can prevent protons from leaking backwards in proton-pumping. The use and activation of two proton conducting channels were also enlightened together with a mechanism by which CcO sorts the chemical protons from pumped protons. The latter problem is referred to as the gating mechanism of CcO, and has remained a challenge in the bioenergetics field for more than three decades. Furthermore, a new method for deriving charge parameters for classical simulations of complex metalloenzymes was developed.

Livets mångfald baserar sig på ett effektivt energiproduktionsmaskineri, som utvecklats under de senaste 3,5 miljarder åren. Detta molekylära maskineri, som också kallas för andningskedjan, befinner sig i eukaryotcellens mitokondrier. Andningskedjan drivs av enzymet cytokrom c oxidas (CcO), som förbrukar nästan allt syre som organismen inandas. CcO reducerar syre till vatten och använder mycket effektivt reaktionens frigjorda energi till att flytta vätejoner (protoner) över mitokondriens inre membran. Precis som i ett batteri uppstår det en spänning över mitokondriens membran, vilken används till att utföra energikrävande processer, t.ex. i produktion av cellens energimolekyl ATP. CcO:s allmänna funktionsprincip har varit känd i tre årtionden, och enzymets atomstruktur utreddes för över tio år sedan. Protonpumpningsmekanismen i CcO är ändå tillsvidare okänd. Med denna mekanism menas den molekylära funktionsprincip med vilken den frigjorda energin från syrereduktionen kopplas till protonöverföring över mitokondriens inre membran. Utredning av den exakta pumpmekanismen är av central betydelse inom biokemin och bioenergetiken eftersom CcO utgör grunden för det aeroba livet. Felfunktion i CcO har visats ha samband med många sjukdomar s.s. Parkinsons sjuka och muskeldegenerationssjukdomar. Dessutom reglerar CcO implicit produktionen av syreradikaler, som har samband t.ex. med degradation av muskelvävnad efter hjärtinfarkt och degradation som sker vid föråldring. CcO:s funktion är också av stort intresse för energiproduktionsindustrin eftersom enzymet fungerar likt en bränslecell, fastän mera effektivt. I framtiden kan möjligen CcO:s effektiva funktionsprincip användas som modell i utvecklingen av bioinspirerade bränsleceller. I min avhandling har jag studerat protonpumpningsmekanismen i CcO med hjälp av teoretisk modellering. Beräkningsmodellerna baserar sig på experimentell strukturinformation, samt resultat från många biokemiska och biofysikaliska experiment. Jag har studerat CcO:s dynamik, energetik och struktur i dess katalytiska cykels olika mellansteg. Beräkningsmodellerna som använts baserar sig på både klassisk- och kvantmekanik, vilka löses med hjälp av effektiva superdatorer. Studierna i denna avhandling utmynnade i sex vetenskapliga artiklar. Som resultat av dessa studier identifierades en specifik aminosyra (Glu-242) nära enzymets aktiva centrum, vilken hindrar de pumpade protonerna från att läcka. Denna aminosyra fungerar delvis som en molekylär motors vevaxel. Dessutom föreslogs en mekanism som CcO använder till att aktivera och växla mellan två protonledande kanaler. En ny metod utvecklades också, som kan användas till att modellera komplicerade enzymatiska metallcentra med hjälp av relativt lätta klassiska beräkningar. Denna metod baserar sig på parametrisering av dessa metallcentra med hjälp av tunga kvantkemiska beräkningar. Parametrarna som härleddes för CcO:s metallcentra användes i många arbeten som ingår i denna avhandling. Det viktigaste resultatet är kanske ändå en ny modell på CcO:s protonpumpningsmekanism, som förklarar hur CcO separerar de protoner som används för pumpning, från protonerna som används i syrereduktionen till vatten. Denna princip kallas för "gating" (eng. "gate" – port), och är en av de viktigaste frågorna i utredningen av CcO:s funktionsprincip.

Elämän monimuotoisuuden perustana on äärimmäisen tehokas energiantuotantokoneisto, joka on kehittynyt viimeisten 3,5 miljardin vuoden aikana. Tämä hengitysketjuksi kutsuttu molekyylikoneisto sijaitsee eukaryoottisolun mitokondrioissa. Hengitysketjua pyörittää sytokromi-c oksidaasi -entsyymi (CcO), joka käyttää lähes kaiken eliön hengittämästä hapesta. CcO pelkistää hapen vedeksi ja käyttää erittäin tehokkaasti reaktiossa vapautuneen energian siirtääkseen vetyioneita (protoneita) mitokondrion sisäkalvon yli. Aivan kuten sormiparistossa, mitokondrion kalvon yli syntyy jännite, jota hyödynnetään energiaa vaativissa prosesseissa esimerkiksi solun energiamolekyyli ATP:n tuottamisessa. CcO:n yleinen toimintaperiaate on tunnettu jo yli 30 vuoden ajan ja entsyymin atomirakenne selvitettiin yli kymmenen vuotta sitten. CcO:n pumppumekanismi on kuitenkin vielä tuntematon. Pumppumekanismilla tarkoitetaan molekyylitason toimintaperiaatetta, jossa hapen pelkistämisessä vapautunut energia kytketään protonin siirtoon mitokondrion sisäkalvon yli (protonipumppaus). Pumppumekanismin tarkka ymmärtäminen on biokemian ja bioenergetiikan kannalta keskeistä, sillä CcO on hapellisen elämän energiantuotannon perusta. CcO:n toiminnan häiriöiden on osoitettu liittyvän moniin sairauksiin, kuten Parkinsonin tautiin ja lihasrappeumatauteihin. Lisäksi happiradikaalien tuotanto, jota CcO epäsuorasti säätelee, liittyy sydäninfarkteissa syntyviin kudosvaurioihin sekä ikääntymisen aiheuttamaan rappeutumiseen. CcO:n toiminta on myös energiateollisuudelle erittäin kiinnostava kysymys, koska entsyymi toimii polttokennon tavoin, vaikkakin paljon tehokkaammin. Tulevaisuudessa voidaan mahdollisesti käyttää CcO:n tehokasta toimintaperiaatetta mallina bioinspiroitujen polttokennojen kehittämisessä. Väitöskirjassani olen tutkinut CcO:n pumppumekanismia käyttäen teoreettista mallinnusta. Tutkimuksessa käytetyt laskentamallit perustuvat kokeelliseen rakenneinformaatioon sekä useiden biokemiallisten ja biofysikaalisten kokeiden tuloksiin. Olen tutkinut CcO:n dynamikkaa, energetiikkaa ja rakennetta entsyymin katalyyttisen kierron eri välitiloissa käyttäen sekä klassista mekaniikkaa että kvanttimekaniikkaa ja suuren tehon supertietokoneita. Tutkimuksen tulokset on julkaistu kuudessa tieteellisessä julkaisussa. Tutkimuksessa havaittiin, että tietty aminohappo (Glu-242) lähellä entsyymin aktiivista keskusta estää pumpattavia protoneita vuotamasta takaisin. Kyseinen aminohappo toimii siis osittain molekyylitason moottorin kampiakselina. Tutkimuksessa ehdotettiin myös mekanismia, jota CcO käyttää kahden eri protoninjohtokanavan aktivoimiseen ja vuorotteluun. Tutkimuksessa kehitettiin lisäksi uusi menetelmä, jonka avulla voidaan mallintaa entsyymien monimutkaisia metallikeskuksia käyttämällä kevyempiä klassisia laskuja ja raskaista kvanttikemiallista laskuista johdettuja parametreja. Näitä parametreja CcO:n metallikeskuksille käytettiin väitöskirjan muissa töissä. Väitöskirjan tärkeimpänä tuloksena voidaan kuitenkin pitää uutta mallia pumppumekanismista. Mallin avulla voidaan selittää, miten CcO erottelee pumpattavat protonit niistä protoneista, jotka käytetään hapen pelkistämisessä vedeksi. Tätä periaatetta kutsutaan "gating" mekanismiksi (eng. gate – portti, "portitus"), joka on yksi tärkeimpiä kysymyksiä CcO:n toimintaperiaatteen selvittämisessä.