The genome packaging machinery of dsDNA bacteriophage PRD1

Viral genomes are encapsidated within protective protein shells. This encapsidation can be achieved either by a co-condensation reaction of the nucleic acid and coat proteins, or by first forming empty viral particles which are subsequently packaged with nucleic acid, the latter mechanism being typical for many dsDNA bacteriophages. Bacteriophage PRD1 is an icosahedral, non-tailed dsDNA virus that has an internal lipid membrane, the hallmark of the Tectiviridae family. Although PRD1 has been known to assemble empty particles into which the genome is subsequently packaged, the mechanism for this has been unknown, and there has been no evidence for a separate packaging vertex, similar to the portal structures used for packaging in the tailed bacteriophages and herpesviruses. In this study, a unique DNA packaging vertex was identified for PRD1, containing the packaging ATPase P9, packaging factor P6 and two small membrane proteins, P20 and P22, extending the packaging vertex to the internal membrane. Lack of small membrane protein P20 was shown to totally abolish packaging, making it an essential part of the PRD1 packaging mechanism. The minor capsid proteins P6 was shown to be an important packaging factor, its absence leading to greatly reduced packaging efficiency. An in vitro DNA packaging mechanism consisting of recombinant packaging ATPase P9, empty procapsids and mutant PRD1 DNA with a LacZ-insert was developed for the analysis of PRD1 packaging, the first such system ever for a virus containing an internal membrane. A new tectiviral sequence, a linear plasmid called pBClin15, was identified in Bacillus cereus, providing material for sequence analysis of the tectiviruses. Analysis of PRD1 P9 and other putative tectiviral ATPase sequences revealed several conserved sequence motifs, among them a new tectiviral packaging ATPase motif. Mutagenesis studies on PRD1 P9 were used to confirm the significance of the motifs. P9-type putative ATPase sequences carrying a similar sequence motif were identified in several other membrane containing dsDNA viruses of bacterial, archaeal and eukaryotic hosts, suggesting that these viruses may have similar packaging mechanisms. Interestingly, almost the same set of viruses that were found to have similar putative packaging ATPases had earlier been found to share similar coat protein folds and capsid structures, and a common origin for these viruses had been suggested. The finding in this study of similar packaging proteins further supports the idea that these viruses are descendants of a common ancestor.

Virukset muodostuvat perimäaineksesta, DNA:sta tai RNA:sta, ja sitä ympäröivästä proteiinikuoresta. Viruksen perimän pakkaaminen proteiinikuoren sisään on tärkeä osa viruksen elinkiertoa solussa, ja kuori varjelee perimäainesta ympäristön rasituksilta viruksen ollessa solun ulkopuolella. Virus voi rakentua joko siten, että kuoriproteiinimolekyylit sitoutuvat perimään, ja perimä ja kuoriproteiinit tiivistyvät valmiiksi virukseksi, tai rakentamalla pallomainen, tyhjä proteiinikuori ensin, minkä jälkeen perimä pakataan kuoren sisään. Bakteriofagi eli bakteerivirus PRD1 on muodoltaan ikosaedri (12-kulmio), mutta poikkeuksellisen PRD1:stä tekee sen proteiinikuoren alla oleva rasvakalvo. Vaikka PRD1:stä on tiedetty, että virus rakentuu tyhjien kuorien eli prokapsidien kautta, tarkkaa mekanismia PRD1:n tai minkään sisäkalvollisen viruksen DNA:n pakkaukselle ei ole aikaisemmin tunnettu. Tässä väitöskirjatyössä on tunnistettu useita PRD1:n pakkauksessa toimivia virusproteiineja sekä havaittu niiden sijaitsevan yhdessä kulmassa, erillään kuoren muissa kulmissa sijaitsevista isäntäsolun tunnistukseen tarvittavista proteiineista. Työssä on tutkittu PRD1:n eri pakkausproteiinien toimintaa, ja mm. kehitetty PRD1:lle ns. in vitro -pakkausmenetelmä, jossa DNA:ta voidaan pakata tyhjiin prokapsideihin koeputkessa, ilman eläviä soluja. Virukset voivat lysogenisoitua, eli vaipua lepotilaan, jossa uusia viruksia ei tuoteta eikä isäntäsolu tuhoudu. Joskus tässä tilassa olevan viruksen perimään voi osua haitallinen mutaatio, joka estää virusta aktivoitumasta. Työssä tunnistettiin bioinformatiikan keinoin PRD1:n ja sen sukulaisen Bam35-viruksen kaltaiseksi eräs Bacillus cereus -bakteerin perimästä löytynyt osa, pBCLin15. pBClin15:n arvellaan olevan joko lepotilassa oleva virus tai mutaatioita kerännyt viruksen jäänne. Työssä havaittiin myös Bam35:n voivan lysogenisoitua. PRD1:n kuoriproteiinin rakenteen on aiemmin todettu olevan hyvin samankaltainen mm. ihmisen adenoviruksen kuoriproteiinin kanssa, ja onkin ehdotettu, että nämä virukset olisivat sukua toisilleen. Sama kuorityyppi on sittemmin löydetty monista eläinten tai muiden aitotumallisten eliöiden viruksista. Tässä tutkimuksessa verrattiin bioinformatiikan keinoin eri virusten DNA-pakkausproteiineja, ja PRD1-tyyppisiä pakkausproteiineja todettiin löytyvän bakteerien, eläinten, levien ja jopa arkkien viruksista. Kyseessä olivat samat virukset, joilla on todettu olevan samankaltainen kuoriproteiini, ja joista monilla on PRD1:n kaltainen sisäkalvo. Tämä havainto tukee siten aiemmin esitettyjä ajatuksia näiden virusten periytymisestä samasta kantaviruksesta. Vaikka PRD1 onkin bakteerien virus, voi samankaltaisten pakkausproteiinien löytyminen muista viruksista viitata siihen, että näiden virusten perimän pakkaus toimii samalla tavoin. Siten PRD1:stä saatu tieto voi auttaa ymmärtämään muidenkin virusten pakkausta, ja jopa tarjota kohteen uusille viruslääkkeille. Ensisijaisesti tämä työ on kuitenkin perustutkimusta ja lisää ymmärtämystämme virusten toiminnasta ja niiden evoluutiosta.