Stress responses of Gram-positive bacteria to cationic antimicrobial peptides

As the resistance of bacteria to conventional antibiotics has become an increasing problem, new antimicrobial drugs are urgently needed. One possible source of new antibacterial agents is a group of cationic antimicrobial peptides (CAMPs) produced by practically all living organisms. These peptides are typically small, amphipathic and positively charged and contain well defined a-helical or b-sheet secondary structures. The main antibacterial action mechanism of CAMPs is considered to be disruption of the cell membrane, but other targets of CAMPs also exist. Some bacterial species have evolved defence mechanisms against the harmful effects of CAMPs. One of the most effective defence mechanisms is reduction of the net negative charge of bacterial cell surfaces. Global analysis of gene expression of two Gram-positive bacteria, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus, was used to further study the stress responses induced by different types of CAMPs. B. subtilis cells were treated with sublethal concentrations of a-helical peptide LL-37, b-sheet peptide protegrin 1 or synthetic analogue poly-L-lysine, and the changes in gene expression were studied using DNA macroarrays. In the case of S. aureus, three different a-helical peptides were selected for the transcriptome analyses: temporin L, ovispirin-1 and dermaseptin K4-S4(1-16). Transcriptional changes caused by peptide stress were examined using oligo DNA microarrays. The transcriptome analysis revealed two main cell signalling mechanisms mediating CAMP stress responses in Gram-positive bacteria: extracytoplasmic function (ECF)sigma factors and two-component systems (TCSs). In B. subtilis, ECF sigma factors sigW and sigM as well as TCS LiaRS responded to the cell membrane disruption caused by CAMPs. In S. aureus, CAMPs caused a similar stress response to antibiotics interfering in cell wall synthesis, and TCS VraSR was strongly activated. All of these transcriptional regulators are known to respond to several compounds other than CAMPs interfering with cell envelope integrity, suggesting that they sense cell envelope stress in general. Among the most strongly induced genes were yxdLM (in B. subtilis) and vraDE (in S. aureus) encoding homologous ABC transporters. Transcription of yxdLM and vraDE operons is controlled by TCSs YxdJK and ApsRS, respectively. These TCSs seemed to be responsible for the direct recognition of CAMPs. The yxdLM operon was specifically induced by LL-37, but its role in CAMP resistance remained unclear. VraDE was proven to be a bacitracin transporter. We also showed that the net positive charge of the cell wall affects the signalrecognition of different TCSs responding to cell envelope stress. Inactivation of the Dlt system responsible for the D-alanylation of teichoic acids had a strong and differential effect on the activity of the studied TCSs, depending on their functional role in cells and the stimuli they sense.

Tauteja aiheuttavien bakteerien lisääntyvä vastustuskyky perinteisiä antibiootteja vastaan on kasvava ongelma terveydenhuollossa. Yksi potentiaalinen uusi vaihtoehto bakteeri-infektioiden hoitoon saattavat olla pienet positiivisesti varautuneet peptidit (ns. kationiset antimikrobipeptidit). Näitä peptideitä tuottavat lähes kaikki elävät organismit aina yksisoluisista eliöistä kasveihin ja eläimiin saakka osana omaa puolustusjärjestelmäänsä. Vain harvat bakteerit ovat vastustuskykyisiä kationisille antimikrobipeptideille. Poikkeuksiakin on, kuten Staphylococcus aureus – bakteeri, joka on yleisin sairaalainfektioiden aiheuttaja Suomessa. S aureus on erittäin vastustuskykyinen useimmille ihmisen tuottamille kationisille antimikrobipeptideille, minkä on ajateltu olevan yksi syy siihen, että kyseinen bakteeri pystyy valloittamaan elintilaa ihmisen iholla ja limakalvoilla ja sopivien olosuhteiden vallitessa aiheuttamaan infektion elimistössä. Tässä tutkimuksessa S. aureus- bakteerit altistettiin erilaisille kationisille antimikrobipeptideille ja pyrittiin tunnistamaan niitä bakteerigeenejä, jotka osallistuvat puolustukseen peptidejä vastaan. Tästä saattaa olla apua tulevaisuudessa uusia lääkkeitä kehitettäessä. Vertailun vuoksi tutkittiin myös toisen mikrobin, Bacillus subtilis- bakteerin, vastetta peptidialtistukseen. Toisin kuin S. aureus, B. subtilis on ihmiselle täysin vaaraton maaperän normaali bakteeri. Näitä kahta bakteeria vertaamalla voitiin selvittää onko taudinaiheuttajille kehittynyt erityisiä mekanismeja kationisten peptidien tuhoamista varten. Tulokset osoittivat, että bakteerien soluseinällä on erittäin tärkeä rooli puolustautumisessa peptidejä vastaan. Myös erityisiä mekanismeja peptidien torjuntaan on olemassa, mutta nämä ovat yleensä erikoistuneet poistamaan lähisukuisten, samassa elinympäristössä olevien bakteerien tuottamia peptidejä. Tulokset antavat viitteitä siitä, että kationisilla antimikrobipeptideillä voisi olla käyttöä infektioiden hoidossa yhdessä perinteisten antibioottien kanssa.