Alternate pathways of the early secretory route in yeast

The diversity of functions of eukaryotic cells is preserved by enclosing different enzymatic activities into membrane-bound organelles. Separation of exocytic proteins from those which remain in the endoplasmic reticulum (ER) casts the foundation for correct compartmentalization. The secretory pathway, starting from the ER membrane, operates by the aid of cytosolic coat proteins (COPs). In anterograde transport, polymerization of the COPII coat on the ER membrane is essential for the ER exit of proteins. Polymerization of the COPI coatomer on the cis-Golgi membrane functions for the retrieval of proteins from the Golgi for repeated use in the ER. The COPII coat is formed by essential proteins; Sec13/31p and Sec23/24p have been thought to be indispensable for the ER exit of all exocytic proteins. However, we found that functional Sec13p was not required for the ER exit of yeast endogenous glycoprotein Hsp150 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Hsp150 turned out to be an ATP phosphatase. ATP hydrolysis by a Walker motif located in the C-terminal domain of Hsp150 was an active mediator for the Sec13p and Sec24p independent ER exit. Our results suggest that in yeast cells a fast track transport route operates in parallel with the previously described cisternal maturation route of the Golgi. The fast track is used by Hsp150 with the aid of its C-terminal ATPase activity at the ER-exit. Hsp150 is matured with a half time of less than one minute. The cisternal maturation track is several-fold slower and used by other exocytic proteins studied so far. Operative COPI coat is needed for ER exit by a subset of proteins but not by Hsp150. We located a second active determinant to the Hsp150 polypeptide s N-terminal portion that guided also heterologous fusion proteins out of the ER in COPII coated vesicles under non-functional COPI conditions for several hours. Our data indicate that ER exit is a selective, receptor-mediated event, not a bulk flow. Furthermore, it suggests the existence of another retrieval pathway for essential reusable components, besides the COPI-operated retrotransport route. Additional experiments suggest that activation of the COPI primer, ADP ribosylation factor (ARF), is essential also for Hsp150 transport. Moreover, it seemed that a subset of proteins directly needed activated ARF in the anterograde transport to complete the ER exit. Our results indicate that coat structures and transport routes are more variable than it has been imagined.

Aitotumallisessa solussa toiminnat osastoituvat rasvakalvojen rajaamiin jaoksiin, joissa on runsaasti kalvonläpäiseviä sekä liukoisia valkuaisaineita eli proteiineja. Niiden laadulla, määrällä ja sijainnilla on perustavaa laatua oleva vaikutus solun hyvinvoinnille ja kommunikoinnille elinympäristössään. Proteiinin sijoitusprosessi alkaa aminohappoketjun rakentuessa solulimakalvostoon. Laskostuttuaan oikeaan muotoon se erotetaan solulimakalvostoon jäävistä proteiineista kalvon ulkopuolelle rakentuvan proteiinikuoren (COPII) yhteyksillä kalvoproteiineihin. Liukoiset erittyvät proteiinit tunnistetaan ja lajitellaan välittäjäaineen avulla. COPII-kuori kuroo proteiineja sisältävän rasvarakkulan irti solukalvostosta ja se sulautuu seuraavaan osastoon Golgin laitteeseen. Golgista proteiinit kuljetetaan toimintakohteeseensa. Tätä tapahtumaa kutsutaan eritysreitiksi. Toinen kuorijärjestelmä, COPI, toimii uudelleen käytettävien osien, kuten välittäjäaineiden palautuksessa takaisin solulimakalvostoon. Olemme tutkineet perusaitotumallisen solun, leivinhiivan liukoisen proteiinin Hsp150:n kuljetusvaihtoehtoja solulimakalvoston ja Golgin laitteen välillä käyttämällä ylälämpötiloissa toimimattomia kuoriproteiinimuotoja. Havaitsimme, että Hsp150-proteiinissa on kaksi ominaisuutta, mitkä ohjaavat sen ulos solulimakalvostosta. Hsp150:n loppupäässä on alue, joka purkaa korkeaenergistä yhdistettä, ATP:tä. Tätä ominaisuutta Hsp150 tarvitsee kulkeakseen reitillä, mikä toimii osan COPII kuoresta (sec13-1, sec24-1) ollessa toimimaton, muiden proteiinien jäädessä solulimakalvostoon. Solulimakalvostosta poistuminen on aktiivista ja valikoivaa, sillä Hsp150 loppupäähän liitettynä muutoin erittymätön testiproteiini erittyi COPII mutanteissa. Lisäksi Hsp150:n kuljetusvauhti solulimakalvostosta läpi Golgin laitteen on nopeampi kuin muiden tutkittujen proteiinien, mikä viittaa toisenlaiseen Golgin läpi kuljetukseen kuin aiemmin hiivassa tunnettu Golgin osastojen kypsymisreitti (cisternal maturation). Kun takaisinkuljetuskuori COPI on toimimaton, Hsp150:n aminohappoketjun keskellä toistuvista aminohapoista rakentuva alue auttaa proteiinia poistumaan solusta useita tunteja. Solulimakalvostosta poistuminen COPII kuoren avulla täytyy jälleen kerran tapahtua välittäjäaineen avulla, koska kuljetus on valikoivaa, osa solun erittyvistä proteiineista jää solulimakalvostoon. Koska Hsp150 kuljetus jatkuu tunteja toimimattomassa COPI-palautusolosuhteissa, solussa on ilmeisesti toinen solulimakalvostoon palauttava reitti. Tuloksemme viittaavat, että syy proteiinien kuljetuksen estymiseen solulimakalvostosta COPI-kuoren ollessa toimimaton saattaa olla estynyt eteenpäin kuljetus, eikä seurannaisvaikutus takaisinkuljetuksen estymisestä. Tutkimuksemme osoittaa hiivasolun proteiinikuljetusreittien olevan monimutkaisempi kuin aiemmin ajateltiin.