Oxygen reduction and proton translocation by cytochrome c oxidase

Energy conversion by living organisms is central dogma of bioenergetics. The effectiveness of the energy extraction by aerobic organisms is much greater than by anaerobic ones. In aerobic organisms the final stage of energy conversion occurs in respiratory chain that is located in the inner membrane of mitochondria or cell membrane of some aerobic bacteria. The terminal complex of the respiratory chain is cytochrome c oxidase (CcO) - the subject of this study. The primary function of CcO is to reduce oxygen to water. For this, CcO accepts electrons from a small soluble enzyme cytochrome c from one side of the membrane and protons from another side. Moreover, CcO translocates protons across the membrane. Both oxygen reduction and proton translocation contributes to generation of transmembrane electrochemical gradient that is used for ATP synthesis and different types of work in the cell. Although the structure of CcO is defined with a relatively high atomic resolution (1.8 Å), its function can hardly be elucidated from the structure. The electron transfer route within CcO and its steps are very well defined. Meanwhile, the proton transfer roots were predicted from the site-specific mutagenesis and later proved by X-ray crystallography, however, the more strong proof of the players of the proton translocation machine is still required. In this work we developed new methods to study CcO function based on FTIR (Fourier Transform Infrared) spectroscopy. Mainly with use of these methods we answered several questions that were controversial for many years: [i] the donor of H+ for dioxygen bond splitting was identified and [ii] the protolytic transitions of Glu-278 one of the key amino acid in proton translocation mechanism was shown for the first time.

Energian muuntaminen eliöissä on bioenergetiikan keskeisin dogmi. Energian otto on tehokkainta aerobisilla eliöillä verrattuna anaerobisiin eliöihin. Energian muuntamisen loppuvaihe tapahtuu aerobisten eliöiden mitokondrioiden sisäkalvolla hengitysketjussa tai anaerobisten bakteereiden solukalvolla. Hengitysketjun päätekompleksi on sytokromi c oksidaasi (CcO) entsyymi tämän tutkimuksen kohde. CcO toimii ensisijaisesti pelkistämällä happea vedeksi. Tämä tapahtuu kun CcO vastaanottaa kalvon toiselta puolelta elektroneja pieneltä ja liukoiselta sytokromi c entsyymiltä sekä protoneja toiselta puolelta. Tämän lisäksi CcO siirtää protoneja kalvon toiselle puolelle. Sekä hapen pelkistyminen että protonien siirtyminen vaikuttavat sähkökemiallisen kalvojännitteen syntymiseen jota solu käyttää ATP valmistuksessa ja erityyppisissä solun toiminnoissa. Vaikka CcO entsyymin rakenne tunnetaan aina 1,8 Å tarkkuuteen saakka, sen toimintaa ei tuskin pelkän rakenteen perusteella voi päätellä. CcO entsyymin sisäinen elektronin siirtoketju välivaiheineen tunnetaan kuitenkin hyvin. Toisaalta protonin siirtymisen perusteita entsyymissä on ennustettu kohdennetun mutageneesin avulla ja myöhemmin todistettu röntgensäde kristallografialla. Tästä huolimatta vankempia todisteita protonin siirtokoneiston yksittäisistä tekijöistä edelleen tarvitaan. Tässä työssä kehitimme uusia FTIR spektroskopiaan perustuvia menetelmiä CcO:n toiminnan selvittämiseksi. Näiden uusien menetelmien avulla pystyimme vastaamaan vuosia kiistanalaisina olleisiin kysymyksiin: [i] hapen kaksoissidoksen H+ donori on nyt tunnistettu sekä [ii] Glu-278, joka on protonin siirtomekanismin tärkeimpiä aminohappoja, proteolyyttiset siirtymät on nyt ensimmäistä kertaa osoitettu.