Structure-Function Studies of GDNF Family Ligand-RET signalling

Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and its family members neurturin (NRTN), artemin (ARTN) and persephin (PSPN) are growth factors, which are involved in the development, differentiation and maintenance of many neuron types. In addition, they function outside of the nervous system, e.g. in the development of kidney, testis and liver. GDNF family ligand (GFL) signalling happens through a tetrameric receptor complex, which includes two glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored GDNF family receptor (GFRα) molecules and two RET (rearranged during transfection) receptor tyrosine kinases. Each of the ligands binds preferentially one of the four GFRα receptors: GDNF binds to GFRα1, NRTN to GFRα2, ARTN to GFRα3 and PSPN to GFRα4. The signal is then delivered by RET, which cannot bind the GFLs on its own, but can bind the GFL-GFRα complex. Under normal cellular conditions, RET is only phosphorylated on the cell surface after ligand binding. At least the GDNF-GFRα1 complex is believed to recruit RET to lipid rafts, where downstream signalling occurs. In general, GFRαs consist of three cysteine-rich domains, but all GFRα4s except for chicken GFRα4 lack domain 1 (D1). We characterised the biochemical and cell biological properties of mouse PSPN receptor GFRα4 and showed that it has a significantly weaker capacity than GFRα1 to recruit RET to the lipid rafts. In spite of that, it can phosphorylate RET in the presence of PSPN and contribute to neuronal differentiation and survival. Therefore, the recruitment of RET to the lipid rafts does not seem to be crucial for the biological activity of all GFRα receptors. Secondly, we demonstrated that GFRα1 D1 stabilises the GDNF-GFRα1 complex and thus affects the phosphorylation of RET and contributes to the biological activity. This may be important in physiological conditions, where the concentration of the ligand or the soluble GFRα1 receptor is low. Our results also suggest a role for D1 in heparin binding and, consequently, in the biodistribution of released GFRα1 or in the formation of the GFL-GFRα-RET complex. We also presented the crystallographic structure of GDNF in the complex with GFRα1 domains 2 and 3. The structure differs from the previously published ARTN-GFRα3 structure in three significant ways. The biochemical data verify the structure and reveal residues participating in the interactions between GFRα1 and GDNF, and preliminarily also between GFRα1 and RET and heparin. Finally, we showed that, the precursor of the oncogenic MEN 2B (multiple endocrine neoplasia type 2) form of RET gets phosphorylated already during its synthesis in the endoplasmic reticulum (ER). We also demonstrated that it associates with Src homology 2 domain-containing protein (SHC) and growth factor receptor-bound protein (GRB2) in the ER, and has the capacity to activate several downstream signalling molecules.

GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), neurturiini, artemiini ja persefiini ovat GDNF-perheen kasvutekijöitä, jotka osallistuvat useiden hermosolutyyppien kehitykseen, erilaistumiseen ja ylläpitoon. Lisäksi ne vaikuttavat hermoston ulkopuolella mm. munuaisen, testiksen ja maksan kehitykseen. Erityisesti GDNF-kasvutekijä on herättänyt paljon tieteellistä mielenkiintoa, sillä GDNF:n on osoitettu edistävän keskiaivojen dopaminergisten hermosolujen elossa pysymistä. Esimerkiksi Parkinsonin taudin oireiden uskotaan johtuvan juuri näiden hermosolujen tuhoutumisesta. GDNF-perheen kasvutekijät välittävät viestinsä soluille reseptorikompleksin avustamana: kaksi GFRα (GDNF family ligand receptor α) molekyyliä ja kaksi RET (rearranged during transfection) molekyyliä muodostavat solun pinnalla kompleksin kahden pysyvästi yhteen liittyneen GDNF-perheen kasvutekijän kanssa. Solukalvon lävistävä RET välittää signaalin solun sisälle, jossa signaali jatkaa kulkuaan. Kaikilla GDNF-perheen kasvutekijöillä on oma GFRα-reseptorinsa, johon ne pääasiassa sitoutuvat: GDNF sitoutuu GFRα1:een, neurturiini GFRα2:een, artemiini GFRα3:een ja persefiini GFRα4:ään. Ainakin GFRα1-molekyylin, RET:n ja GDNF:n muodostaman kompleksin uskotaan syntyvän solukalvon erikoistuneissa osissa, ns. lipidilautoilla. GFRα-molekyylit koostuvat yleensä kolmesta osasta, joita kutsutaan domeeneiksi. GFRα4 tekee kuitenkin poikkeuksen: useimpien eläinlajien GFRα4:stä ensimmäinen domeeni puuttuu kokonaan. Työssämme karakterisoimme hiiren GFRα4-molekyylin ominaisuuksia ja osoitimme, että GFRα4:n, persefiinin ja RET:n kompleksi ei muodostu lipidilautoilla. Tästä huolimatta persefiini ja GFRα4 pystyvät yhdessä RET:n kanssa edistämään hermosolujen erilaistumista ja elossa pysymistä. Näyttää siis siltä, että kompleksin muodostuminen lipidilautoilla ei ole välttämätöntä kompleksin biologisen aktiivisuuden kannalta. Tutkimme myös GFRα1-molekyylin ensimmäisen domeenin merkitystä molekyylin toiminnalle ja osoitimme, että ensimmäinen domeeni myötävaikuttaa GFRα1-molekyylin biologiseen aktiivisuuteen. Tuloksemme osoittavat myös, että tämä domeeni saattaa osallistua solunulkoisen hepariinin sitomiseen ja siten vaikuttaa esimerkiksi liukoisen GFRα1-molekyylin leviämiseen kudoksissa. Lisäksi selvitimme GDNF-GFRα1-kompleksin kolmiulotteisen rakenteen. Rakenteen ja biokemiallisten kokeiden tulosten perusteella tiedämme, mitkä osat GDNF:stä ja GFRα1:stä ovat kosketuksissa toisiinsa, ja pystymme arvioimaan mitkä GFRα1:n osat ovat mahdollisesti kosketuksissa RET:iin tai hepariiniin. Edellisten ohella tutkimme RET-reseptorin syöpää aiheuttavaa muunnosta, RETMEN 2B:tä, ja havaitsimme, että tämän reseptorin esimuoto aktivoituu jo syntyvaiheensa aikana solun sisällä, vaikka normaalisti RET voi toimia vain kypsänä reseptorina solun pinnalla. Tällä aktivoitumisella saattaa olla vaikutusta syöpäsolujen epänormaaliin kasvuun. Tuloksemme antavat arvokasta ja uutta tietoa GDNF-perheen kasvutekijöiden ja niiden reseptorien rakenteesta ja toiminnasta. Nämä havainnot auttavat selittämään kyseisten molekyylien toimintaa ihmiskehon kudoksissa ja saattavat näin olla merkittäviä suunniteltaessa uusia lääkehoitoja esimerkiksi neurodegeneratiivisiin sairauksiin tai joihinkin syöpätyyppeihin.