LFA-1 Integrin beta2 Chain Phosphorylation Regulates Protein Interactions and Mediates Signals in T Cells

Integrins are heterodimeric transmembrane adhesion receptors composed of alpha- and beta-subunits and they are vital for the function of multicellular organisms. Integrin-mediated adhesion is a complex process involving both affinity regulation and coupling to the actin cytoskeleton. Integrins also function as bidirectional signaling devices, regulating cell adhesion and migration after inside-out signaling, but also signal into the cell to regulate growth, differentiation and apoptosis after ligand binding. The LFA-1 integrin is exclusively expressed in leukocytes and is of fundamental importance for the function of the immune system. The LFA-1 integrins have short intracellular tails, which are devoid of catalytic activity. These cytoplasmic domains are important for integrin regulation and both the alpha and beta chain become phosphorylated. The alpha chain is constitutively phosphorylated, but the beta chain becomes phosphorylated on serine and functionally important threonine residues only after cell activation. The cytoplasmic tails of LFA-1 bind to many cytoskeletal and signaling proteins regulating numerous cell functions. However, the molecular mechanisms behind these interactions have been poorly understood. Phosphorylation of the cytoplasmic tails of the LFA-1 integrin could provide a mechanism to regulate integrin-mediated cytoskeletal interactions and take part in T cell signaling. In this study, the effects of phosphorylation of LFA-1 integrin cytoplasmic tails on different cellular functions were examined. Site-specific phosphorylation of both the alpha- and beta-chains of the LFA-1 was shown to have a role in the regulation of the LFA-1 integrin.Alpha-chain Ser1140 is needed for integrin conformational changes after chemokine- or integrin ligand-induced activation or after activation induced by active Rap1, whereas beta-chain binds to 14-3-3 proteins through the phosphorylated Thr758 and mediates cytoskeletal reorganization. Thr758 phosphorylation also acts as a molecular switch to inhibit filamin binding and allows 14-3-3 protein binding to integrin cytoplasmic domain, and it was also shown to lead to T cell adhesion, Rac-1/Cdc42 activation and expression of the T cell activation marker CD69, indicating a signaling function for Thr758 phosphorylation in T cells. Thus, phosphorylation of the cytoplasmic tails of LFA-1 plays an important role in different functions of the LFA-1 integrin in T cells. It is of vital importance to study the mechanisms and components of integrin regulation since leukocyte adhesion is involved in many functions of the immune system and defects in the regulation of LFA-1 contributes to auto-immune diseases and fundamental defects in the immune system.

Taustaa Ihmisen immuunipuolustusjärjestelmän soluihin kuuluvat veren valkosolut eli leukosyytit. Ne puolustavat meitä viruksia, bakteereita ja syöpää vastaa. T-solut muodostavat leukosyytti-alaluokan, jotka vastaavat ns. soluvälitteisestä puolustuksesta eli ne auttavat muita valkosoluja puolustustehtävissä ja tappavat myös virusinfektoituneita soluja. Terveessä elimistössä leukosyytit kiertelevät verenkierron mukana, josta ne siirtyvät imunesteeseen ja kulkevat imusolmukkeiden läpi etsien vieraita taudinaiheuttajia. Kun leukosyytit kohtaavat taudinaiheuttajan toisen solun pinnalla, ne aktivoituvat nopeasti, tarttuvat toisiin soluihin tarttujamolekyylien avulla ja immuunivaste alkaa. Solujen tarttuminen toisiinsa (adheesio) on keskeinen osa elimistön immuunipuolustusta, jota pitää voida säädellä aktiivisesti. Jos elimistön leukosyyttien toiminnassa on häiriöitä, ne voivat hyökätä elimistön omia rakenteita vastaan josta ovat seurauksena autoimmuunisairaudet. Leukosyyttien adheesio liittyy oleellisesti myös kaikkiin neljään suurimpaan tautiryhmään - syöpätauteihin, tulehduksiin, traumaperäisiin tauteihin ja infektioihin. Lääkkeillä, jotka estävät leukosyyttien toimintaa, hoidetaan mm. psoriasista, multippeliskleroosia, astmaoireita, kudossiirrännäisten hylkimisreaktioita ja veritulppien jälkeisiä tiloja. Leukosyyttien adheesiosta vastaavat pääasiassa solukalvon leukosyytti-integriinit (LFA-1). Yksi LFA-1 molekyyli koostuu kahdesta eri ketjusta, alpha- ja beta-ketjusta, ja ne lävistävät solun kalvon eli LFA-1 vaikuttaa leukosyyttien toimintaan sekä solun ulkopuolella että sisäpuolella. Jotta leukosyytit eivät tarttuisi muihin soluihin jatkuvasti ja aiheuttaisi näin häiriöitä immuunijärjestelmässä, LFA-1 esiintyy normaalisti solujen pinnalla inaktiivisessa muodossa. Tässä inaktiivisessa muodossa LFA-1:n tarttumiskyky toisten solujen pinnalla oleviin vastinmolekyyleihin on alhainen. Kun leukosyytti kohtaa taudinaiheuttajan ja solu aktivoituu, se antaa LFA-1:lle signaalin muuttaa muotoaan, jolloin sen tarttumiskyky vastinmolekyyleihin kasvaa ja solut tarttuvat toisiinsa. Leukosyyttien on päästävä kulkemaan verisuonien seinämien läpi infektioalueille. Tätä tapahtumaa auttavat verisuonien pinnan solut tuottaen välittäjäaineita, jotka houkuttelevat leukosyyttejä infektoituneelle alueelle. Leukosyytit kerääntyvät paikalla, aktivoivat LFA-1-integriin ja tarttuvat sen avulla verisuonienseinämien soluihin, kulkevat seinämän läpi ja edelleen kudoksen sisällä infektioalueelle. Leukosyytti-integriinien tarttumista on siis säädeltävä tarkoin, jotta elimistön puolustusmekanismit toimivat oikealla tavalla oikealla hetkellä. Tutkimuksen tulokset Tässä väitöskirjatyössä on tarkasteltu LFA-1:n sekä alpha- että beta-ketjun solunsisäisten osien vaikutusta T-solujen aktivaatioon taudinaiheuttajan tunnistamisen jälkeen. Olemme osoittaneet että alpha-ketju on tärkeä LFA-1:n muodonmuutoksessa inaktiivisesta aktiiviseksi, kun taas beta-ketju auttaa solua muuttamaan muotoaan, jotta se voi tarttua paremmin toisiin soluihin ja aktivoida T-solun toimimaan soluvälitteisessä puolustuksessa. Lisäksi olemme tutkineet, kuinka tietyt solunsisäiset proteiinit (taliini, 14-3-3 ja filamiini) sitoutuvat beta-ketjun solunsisäiseen osaan ja onko näillä proteiineilla vaikutusta LFA-1:n aktivaatioon. Osoitimme, että LFA-1:n solunsisäiseen osaan liitetty fosfaattiryhmä säätelee näiden proteiinien sitoutumista ja siten myös LFA-1:n ja T-solun aktivaatiota. Leukosyytti-integriinien toiminnan perusteellinen tunteminen on tärkeää, sillä näin voidaan kehittää hyvin spesifisiä lääkkeitä autoimmuunisairauksiin sekä muihin patologisiin tiloihin, joissa integriinit toimivat taudin etenemisessä.