Characterization of the molecular components and function of BARE-1, Hin-Mu and Mu transposition machineries

Transposable elements, transposons, are discrete DNA segments that are able to move or copy themselves from one locus to another within or between their host genome(s) without a requirement for DNA homology. They are abundant residents in virtually all the genomes studied, for instance, the genomic portion of TEs is approximately 3% in Saccharomyces cerevisiae, 45% in humans, and apparently more than 70% in some plant genomes such as maize and barley. Transposons plays essential role in genome evolution, in lateral transfer of antibiotic resistance genes among bacteria and in life cycle of certain viruses such as HIV-1 and bacteriophage Mu. Despite the diversity of transposable elements they all use a fundamentally similar mechanism called transpositional DNA recombination (transposition) for the movement within and between the genomes of their host organisms. The DNA breakage and joining reactions that underlie their transposition are chemically similar in virtually all known transposition systems. The similarity of the reactions is also reflected in the structure and function of the catalyzing enzymes, transposases and integrases. The transposition reactions take place within the context of a transposition machinery, which can be particularly complex, as in the case of the VLP (virus like particle) machinery of retroelements, which in vivo contains RNA or cDNA and a number of element encoded structural and catalytic proteins. Yet, the minimal core machinery required for transposition comprises a multimer of transposase or integrase proteins and their binding sites at the element DNA ends only. Although the chemistry of DNA transposition is fairly well characterized, the components and function of the transposition machinery have been investigated in detail for only a small group of elements. This work focuses on the identification, characterization, and functional studies of the molecular components of the transposition machineries of BARE-1, Hin-Mu and Mu. For BARE-1 and Hin-Mu transpositional activity has not been shown previously, whereas bacteriophage Mu is a general model of transposition. For BARE-1, which is a retroelement of barley (Hordeum vulgare), the protein and DNA components of the functional VLP machinery were identified from cell extracts. In the case of Hin-Mu, which is a Mu-like prophage in Haemophilus influenzae Rd genome, the components of the core machinery (transposase and its binding sites) were characterized and their functionality was studied by using an in vitro methodology developed for Mu. The function of Mu core machinery was studied for its ability to use various DNA substrates: Hin-Mu end specific DNA substrates and Mu end specific hairpin substrates. The hairpin processing reaction by MuA was characterized in detail. New information was gained of all three machineries. The components or their activity required for functional BARE-1 VLP machinery and retrotransposon life cycle were present in vivo and VLP-like structures could be detected. The Hin-Mu core machinery components were identified and shown to be functional. The components of the Mu and Hin-Mu core machineries were partially interchangeable, reflecting both evolutionary conservation and flexibility within the core machineries. The Mu core machinery displayed surprising flexibility in substrate usage, as it was able to utilize Hin-Mu end specific DNA substrates and to process Mu end DNA hairpin substrates. This flexibility may be evolutionarily and mechanistically important.

Kaikkien eliöiden perimä koostuu geeneistä jotka ohjeistavat elintärkeitä toimintoja, sekä ns. toistuvista DNA-jaksoista joiden osuus perimästä vaihtelee, ollen bakteereilla n. 3%, ihmisellä 45% ja joillain kasveilla jopa yli 70%. Näitä toistojaksoja pidettiin aikoinaan turhana "roska DNA:na" koska niiden toiminnasta ei ollut tietoa. Liikkuvat geneettiset elementit, "hyppivät geenit" eli transposonit ovat osa tätä toistuvaa DNA:ta. Tänä päivänä tiedetään että näillä elementeillä on tärkeä merkitys perimän evoluutiossa, ja jopa geenien synnyssä. Esimerkiksi nisäkkäiden immuunipuolustuksen vasta-ainegeenien uudelleenjärjestelymekanismin ajatellaan kehittyneen transposonisysteemistä. Bakteereilla antibioottien vastustuskykyä koodaavat geenit siirtyvät usein solusta toiseen transposonien välityksellä. Myös eräät virukset kuten HIV-1 ja bakteerivirus Mu toimivat kuten transposonit. Huolimatta transposonien monimuotoisuudesta ne kaikki käyttävät hyvin samanlaista liikkumismekanismia, transpositiota. Transposonit kokoavat transpositiokoneiston jossa yksinkertaisimmillaan transposaasi proteiinit ovat sitoutuneet transposoni DNA:n päihin muodostaen DNA-proteiinikompleksin (ydinkoneiston). Tässä kompleksissa transposaasi katalysoi kemialliset reaktiot, DNA:n katkaisun ja uudelleen liittämisen, ja tämän koneiston avulla transposoni liikkuu paikasta toiseen. Se kuinka nämä koneistot kootaan ja kuinka ne molekyylitasolla toimivat määrittää monia ominaisuuksia transposonin elinkierrossa. Tässä työssä tutkittiin kolmen transposonin transpositiokoneistoja, tunnistettiin niiden molekulaariset (proteiini ja DNA) komponentit, sekä tutkittiin niiden ominaispiirteitä ja toiminnallisuutta. Ensimmäisessä osassa tutkimme ohran retrotransposonia, BARE-1:a, jonka elämänkiertoon oletettavasti kuuluu RNA välivaihe ja viruksen kaltaiset partikkelit (VLP:t), jotka muistuttavat rakenteeltaan ja toiminnaltaan viruksia ja toimivat retrotransposonin transpositiokoneistona. Etsimme ohran solu-uutteista BARE-1:n VLP-koneiston komponentteja sekä koottuja VLP-koneistoja. Osoitimme että kaikki proteiini ja DNA komponentit jotka tarvitaan toiminnalliseen VLP-koneistoon voidaan havaita puhdistetuista ohran solu-uutteista. Elektronimikroskopian avulla havaitsimme myös rakenteita jotka muistuttavat viruksen kaltaisia partikkeleja. Työmme tulokset viittaavat siihen että BARE-1 voi olla aktiivinen retrotransposoni, joka kokoaa VLP-koneiston ja käyttää sitä liikkumiseen ohran perimässä. Toinen ja kolmas osa tutkimuksesta käsittelee transpositiota hyväksikäyttäviä bakteeriviruksia. Bakteerivirus Mu voi infektoida useita bakteerilajeja ja liittyä transpositiolla bakteerin perimään pysyen siellä piilevänä lisääntymättä (provirus). Vaihtoehtoisesti se voi lisääntyä bakteerisolussa monistumalla transposition avulla, jolloin isäntäsolu kuolee ja satoja uusia viruksia vapautuu etsimään uutta isäntäsolua. Mu on toiminut transposonitutkimuksen mallina, ja sen transpositiokoneiston toiminta tunnetaan tarkkaan, sillä sen liikkumismekanismina on jo pitkään voitu tutkia tehokkaasti ja yksinkertaisesti koeputkiolosuhteissa. Toiminnallinen Mu:n transpositiokoneisto voidaan koota koeputkessa käyttämällä transposaasiproteiini MuA:ta ja Mu:n DNA:n päitä. Tämän ydinkoneiston toimintaa voidaan tutkia molekyylitasolla. Muita Mu:n kaltaisia transposoniviruksia on tutkittu hyvin vähän. H. influenzae bakteerin perimässä on Mu-viruksen kaltainen DNA jakso, jonka nimesimme Hin-Mu profaagiksi. Tässä työssä määritimme Hin-Mu:n ydinkoneiston proteiini ja DNA komponentit, tuotimme ja puhdistimme ko. komponentteja ja tutkimme niiden ominaispiirteitä vertaamalla niitä Mu:n vastaaviin komponentteihin, ja osoitimme Hin-Mu:n ydinkoneiston olevan toiminnallinen vastaavissa koeputkiolosuhteissa joissa Mu:n transpositiota tutkitaan. Hin-Mu on ensimmäinen Mu:n kaltainen profaagi jonka transpositiokoneisto on tunnistettu ja osoitettu toiminnalliseksi. Työmme myös osoitti, että Mu:n ja Hin-Mu:n transpositiokoneistot ovat rakenteeltaan hyvin samankaltaisia, mutta omaavat tiettyjä toiminnallisia erilaisuuksia. Osoitimme myös että Mu transpositiokoneiston MuA transposaasi on hyvin joustava ja pystyy hyväksikäyttämään myös Hin-Mu:n transpositiokoneiston DNA komponentteja. Mu:n koneiston joustavuutta tutkittiin lisää käyttämällä ns. silmukkamuotoisia Mu DNA:n päitä (substraatteja), sillä tiedetään että osa transposoneista irrottautuu isäntänsä perimästä muodostamalla välituotteena ns. DNA:n silmukkarakenteen (hairpin). Tutkimme Mu:n koneiston kykyä käyttää hyväkseen tällaisia silmukkamuotoisia DNA substraatteja. Tutkimuksemme osoitti, että Mu:n transpositiokoneisto on niin joustava että se kykenee ottamaan erilaisia silmukkarakenteisia DNA substraatteja koneistona osaksi, avaamaan suljetut DNA silmukat, ja liittämään ne uuteen kohde DNA:han. Työ osoitti uudenlaista joustavuutta Mu:n transpositiokoneistolta ja MuA proteiinilta DNA substraattiin sitoutumisessa ja sen prosessoinnissa. Havaittu transpositiokoneiston joustavuus voi olla sekä evolutiivisesti että mekanistisesti tärkeää.