Bending the Rules of Cell Protrusions : Molecular Mechanisms and Biological Roles of Inverse-BAR Proteins in Cell Morphogenesis

Plasma membrane adopts myriad of different shapes to carry out essential cellular processes such as nutrient uptake, immunological defence mechanisms and cell migration. Therefore, the details how different plasma membrane structures are made and remodelled are of the upmost importance. Bending of plasma membrane into different shapes requires substantial amount of force, which can be provided by the actin cytoskeleton, however, the molecules that regulate the interplay between the actin cytoskeleton and plasma membrane have remained elusive. Recent findings have placed new types of effectors at sites of plasma membrane remodelling, including BAR proteins, which can directly bind and deform plasma membrane into different shapes. In addition to their membrane-bending abilities, BAR proteins also harbor protein domains that intimately link them to the actin cytoskeleton. The ancient BAR domain fold has evolved into at least three structurally and functionally different sub-groups: the BAR, F-BAR and I-BAR domains. This thesis work describes the discovery and functional characterization of the Inverse-BAR domains (I-BARs). Using synthetic model membranes, we have shown that I-BAR domains bind and deform membranes into tubular structures through a binding-surface composed of positively charged amino acids. Importantly, the membrane-binding surface of I-BAR domains displays an inverse geometry to that of the BAR and F-BAR domains, and these structural differences explain why I-BAR domains induce cell protrusions whereas BAR and most F-BAR domains induce cell invaginations. In addition, our results indicate that the binding of I-BAR domains to membranes can alter the spatial organization of phosphoinositides within membranes. Intriguingly, we also found that some I-BAR domains can insert helical motifs into the membrane bilayer, which has important consequences for their membrane binding/bending functions. In mammals there are five I-BAR domain containing proteins. Cell biological studies on ABBA revealed that it is highly expressed in radial glial cells during the development of the central nervous system and plays an important role in the extension process of radial glia-like C6R cells by regulating lamellipodial dynamics through its I-BAR domain. To reveal the role of these proteins in the context of animals, we analyzed MIM knockout mice and found that MIM is required for proper renal functions in adult mice. MIM deficient mice displayed a severe urine concentration defect due to defective intercellular junctions of the kidney epithelia. Consistently, MIM localized to adherens junctions in cultured kidney epithelial cells, where it promoted actin assembly through its I-BAR andWH2 domains. In summary, this thesis describes the mechanism how I-BAR proteins deform membranes and provides information about the biological role of these proteins, which to our knowledge are the first proteins that have been shown to directly deform plasma membrane to make cell protrusions.

Elämän perusyksikkö on solu, jonka ympäröivä solukalvo erottaa ulkomaailmasta. Solukalvo voi saada tarvittaessa eri muotoja, jotka palvelevat solulle tärkeitä prosesseja, kuten ravinteiden sisäänottoa, immunologisia puolustusmekanismeja sekä solun liikkumista. Solukalvon taipuminen eri muotoihin on riippuvaista dynaamisen aktiinitukirangan tuottamasta voimasta. Tämän lisäksi eukaryoottisoluista on hiljattain löydetty proteiineja, joilla on niin kutsuttu BAR domeeni, jonka avulla nämä proteiinit sitoutuvat solukalvoon ja taivuttavat sitä sisäänpäin. Tätä tapahtuu muun muassa endosytoosissa, jossa BAR proteiinit taivuttavat solukalvoa rakkulamaiseksi rakenteeksi, jonka kautta siirtyy materiaalia solun sisään. Samalla BAR proteiinit rekrytoivat aktiinitukirangan säätelijöitä paikalle. Tässä väitöskirjatutkimuksessa karakterisoitiin uusi solukalvon muotoa säätelevä mekanismi, joka on käänteinen sille, mitä muut tunnetut BAR domeenit käyttävät. Havaitsimme, että BAR domeenille sukua oleva I-BAR domeeni kykenee muodostamaan solu-ulokkeita taivuttamalla solukalvoa ulospäin. Puhdistetuilla I-BAR domeeni-proteiineilla ja keinotekoisilla solukalvoilla tekemämme kokeet osoittivat, että I-BAR domeenin positiivisesti varautuneet aminohapot sitovat voimakkaasti solukalvon fosfolipidejä sähköstaattisen vuorovaikutuksen avulla ja pystyvät täten taivuttamaan solukalvoa vastaamaan proteiinin rakennetta. Rakenteellisten eroavaisuuksien takia I-BAR domeenit taivuttavat solukalvoa päinvastaiseen suuntaan kuin BAR ja F-BAR domeenit. Nisäkkäissä on yhteensä viisi eri I-BAR proteiinia koodaavaa geeniä. Havaitsimme, että evolutiivisesti eri perheisiin kuuluvat I-BAR domeenit käyttävät osin eri mekanismeja vuorovaikutuksessaan solukalvon kanssa. Tutkimme myös tämän solukalvoa ulospäin taivuttavan mekanismin merkitystä eläinsoluille. Solubiologiset kokeemme osoittivat, että I-BAR proteiini ABBA ilmentyy voimakkaasti yksilönkehityksen aikana gliasoluissa, joissa se säätelee aktiinitukirangan ja solukalvon vuorovaikutustaja ja täten edistää solujen pituuskasvua. Väitöskirjan neljännessä osatyössä analysoimme hiiriä, joissa I-BAR proteiinia koodaava geeni MIM on inaktivoitu. Tutkimuksemme osoittivat, että MIM-poistogeenisille hiirille kehittyy progressiivinen munuaistauti, jossa munuaisten epiteelisolusidokset heikkenevät, mistä seuraa munuaisten vajaatoimintaa. Solubiologiset kokeet osoittivat, että MIM lokalisoituu munuaisten epiteelisoluissa soluliitoksiin, joissa se edesauttaa aktiinifilamenttien muodostumista käyttäen hyväkseen solukalvoa ja aktiinia sitovia domeenejaan. Yhdessä nämä tulokset osoittavat ensimmäistä kertaa, kuinka solukalvoa sitovat proteiinit pystyvät yhteistyössä aktiinitukirangan kanssa muodostamaan solu-ulokkeita taivuttamalla solukalvoa ulospäin. Tässä työssä esitetyt tulokset osoittavat myös, että solut hyödyntävät tätä mekanismia liikkumisessaan ja liitostensa ylläpidossa. Yhdessä nämä löydökset lisäävät tietämystämme solun perustoiminnoista ja niiden säätelystä.