Rhizoctonia -Scots pine interactions: detection, impact on seedling performance and host defence gene response

Rhizoctonia spp. are ubiquitous soil inhabiting fungi that enter into pathogenic or symbiotic associations with plants. In general Rhizoctonia spp. are regarded as plant pathogenic fungi and many cause root rot and other plant diseases which results in considerable economic losses both in agriculture and forestry. Many Rhizoctonia strains enter into symbiotic mycorrhizal associations with orchids and some hypovirulent strains are promising biocontrol candidates in preventing host plant infection by pathogenic Rhizoctonia strains. This work focuses on uni- and binucleate Rhizoctonia (respectively UNR and BNR) strains belonging to the teleomorphic genus Ceratobasidium, but multinucleate Rhizoctonia (MNR) belonging to teleomorphic genus Thanatephorus and ectomycorrhizal fungal species, such as Suillus bovinus, were also included in DNA probe development work. Strain specific probes were developed to target rDNA ITS (internal transcribed spacer) sequences (ITS1, 5.8S and ITS2) and applied in Southern dot blot and liquid hybridization assays. Liquid hybridization was more sensitive and the size of the hybridized PCR products could be detected simultaneously, but the advantage in Southern hybridization was that sample DNA could be used without additional PCR amplification. The impacts of four Finnish BNR Ceratorhiza sp. strains 251, 266, 268 and 269 were investigated on Scot pine (Pinus sylvestris) seedling growth, and the infection biology and infection levels were microscopically examined following tryphan blue staining of infected roots. All BNR strains enhanced early seedling growth and affected the root architecture, while the infection levels remained low. The fungal infection was restricted to the outer cortical regions of long roots and typical monilioid cells detected with strain 268. The interactions of pathogenic UNR Ceratobasidium bicorne strain 1983-111/1N, and endophytic BNR Ceratorhiza sp. strain 268 were studied in single or dual inoculated Scots pine roots. The fungal infection levels and host defence-gene activity of nine transcripts [phenylalanine ammonia lyase (pal1), silbene synthase (STS), chalcone synthase (CHS), short-root specific peroxidase (Psyp1), antimicrobial peptide gene (Sp-AMP), rapidly elicited defence-related gene (PsACRE), germin-like protein (PsGER1), CuZn- superoxide dismutase (SOD), and dehydrin-like protein (dhy-like)] were measured from differentially treated and un-treated control roots by quantitative real time PCR (qRT-PCR). The infection level of pathogenic UNR was restricted in BNR- pre-inoculated Scots pine roots, while UNR was more competitive in simultaneous dual infection. The STS transcript was highly up-regulated in all treated roots, while CHS, pal1, and Psyp1 transcripts were more moderately activated. No significant activity of Sp-AMP, PsACRE, PsGER1, SOD, or dhy-like transcripts were detected compared to control roots. The integrated experiments presented, provide tools to assist in the future detection of these fungi in the environment and to understand the host infection biology and defence, and relationships between these interacting fungi in roots and soils. This study further confirms the complexity of the Rhizoctonia group both phylogenetically and in their infection biology and plant host specificity. The knowledge obtained could be applied in integrated forestry nursery management programmes.

Rhizoctonia-suvun sienet ovat maaperässä yleisesti esiintyviä sieniä, jotka voivat olla tautia aihettavia patogeeneja tai muodostaa hyödyllisiä symbionttisia vuorovaikutussuhteita kasvien kanssa. Yleensä Rhizoctonia spp. sienet ovat kasvipatogeeneja aiheuttaen mm. juurilahotautia niin metsäpuille kuin viljelykasveillekin. Useat Rhizoctonia–suvun sienet muodostavat orchidea-kasveille elintärkeitä symbionttisia sienijuuria (mykorritsa) ja jotkut tauteja aiheuttamattomista Rhizoctonia-kannoista voivat estää patogeenisten kantojen infektion tutkituilla kasveilla. Tässä työssä keskityttiin yksi- ja kaksitumaisiin Rhizoctonia- sieniin, jotka kuuluvat teleomorfi Ceratobasidium-sukuun, mutta DNA koettimet kehitettiin myös monitumaiselle Rhizoctonia-sienelle (teleomorfi Thanatephorus) ja nummitatti-ektomykorritsasienelle (Suillus bovinus). Kantaspesifiset koettimet suunniteltiin ribosomaalisen DNA:n ”internal transcribed spacer” (ITS) -alueelle (ITS1, 5.8S ja ITS2) ja valmistettuja koettimia käytettiin “Southern dot blot”- ja nestemäisen hybridisaatiomenetelmän vertailuun. Nestemäinen hybridisaatio oli herkempi ja siinä voitiin määrittää myös hybridisoituvan PCR-tuotteen koko, mutta ”Southern” hybridisaation etuna oli, että koettimen hybridisoinnissa voitiin käyttää suoraan sienistä eristettyä kokonais-DNA:ta, jolloin PCR-reaktiota ei tarvittu. Työssä tutkittiin suomalaisten kaksitumaisten Rhizoctonia-kantojen (Ceratorhiza sp.) 251, 266, 268 and 269 vaikutusta männyn (Pinus sylvestris) taimien kasvuun ja infektiobiologiaan. Infektion taso määritettiin mikroskopoimalla trypaanisinellä värjättyjä infektoituja juuria. Kaikki kaksitumaiset Rhizoctonia-kannat tehostivat nuorten taimien kasvua ja vaikuttivat juurten ulkomuotoon (lyhytjuurien määrä, juurten paksuus jne.), vaikka infektion määrä pysyikin alhaisena. Infektio keskittyi juuren uloimpaan kuorikerrokseen ja näille sienille tyypillisiä ”monilioid”-soluja oli nähtävissä 268 kannalla infektoiduissa juurten soluissa. Patogeenisen yksitumaisen Rhizoctonia-sienen (Ceratobasidium bicorne) 1983-111/1N ja endofyyttisen kaksitumaisen Rhizoctonia-sienen (Ceratorhiza sp.) 268 infektiobiologiaa ja vuorovaikutusta tutkittiin kummallakin kannalla yksinään sekä molemmilla kannoilla samanaikaisesti infektoiduissa männyn juurissa. Sieni-infektion määrä ja männyn transkriptioaktiivisuus määritettiin kaikista käsitellyistä juurista ja verrokkijuurista kvantitatiivisella ”real time PCR” –menetelmällä (qRT-PCR) seuraavien entsyymien osalta: fenyylialaniiniammoniumlyaasi (pal1), stilpeenisyntetaasi (STS), kalkonisyntetaasi (CHS), lyhytjuurispesifinen peroksidaasi (Psyp1), mikrobeja hylkivä peptidi (Sp-AMP), nopean puolustusreaktion aktivaation liittyvä geeni (PsACRE), germiinin kaltainen proteiini (PsGER1), CuZn- superoksididismutaasi (SOD) ja dehydriinin kaltainen proteiini (dhy-like). Taimien siirrostus kaksitumaisella Rhizoctonia-sienellä ennen yksitumaisen Rhizoctonia-sienen infektiota rajoitti yksitumaisen kannan määrää, mutta yksitumainen Rhizoctonia oli tehokkaampi infektoimaan juuria, kun sienet siirrostettiin samanaikaisesti. Stilpeenisyntetaasin geenituotetta syntetisoitiin erittäin tehokkaasti kaikissa käsittelyissä, mutta kalkonisyntaasi, fenyylialaniiniammoniumlyaasi ja peroksidaasi aktivoituivat vain kohtalaisesti. Geenien Sp-AMP, PsACRE, PsGER1, SOD, ja dhy-like transkriptioaktiivisuuksissa ei havaittu merkittäviä muutoksia verrokkeihin nähden. Työssä kehitetyt koettimet mahdollistavat kyseisten sienten osoittamisen juuristosta ja maaperästä. Tehty tutkimus auttaa ymmärtämään Rhizoctonia-sienten infektiobiologiaa, eri Rhizoctonia-kantojen vuorovaikutus-suhteita männyssä, sekä männyn puolustusreaktiota Rhizoctonia-infektion aikana. Tämä työ todisti aiemman käsityksen näiden sienten monimutkaisesta fylogeniasta, monimuotoisesta infektiobiologiasta ja isäntäspesifisyydestä. Tutkimuksesta saatua tietoa patogeenisen ja endofyyttisen Rhizoctonia-sienen infektiobiologian eroista ja männyn puolustusreaktiosta voidaan hyödyntää entistä tehokkaampien torjuntamenetelmien kehittämiseksi sienitauteja vastaan.