Lymphatic vessels in health and disease: Role of the VEGF-C/VEGFR-3 pathway and the transcription factor FOXC2

The circulatory system consists of two vessel types, which act in concert but significantly differ from each other in several structural and functional aspects as well as in mechanisms governing their development. The blood vasculature transports oxygen, nutrients and cells to tissues whereas the lymphatic vessels collect extravasated fluid, macromolecules and cells of the immune system and return them back to the blood circulation. Understanding the molecular mechanisms behind the developmental and functional regulation of the lymphatic system long lagged behind that of the blood vasculature. Identification of several markers specific for the lymphatic endothelium, and the discovery of key factors controlling the development and function of the lymphatic vessels have greatly facilitated research in lymphatic biology over the past few years. Recognition of the crucial importance of lymphatic vessels in certain pathological conditions, most importantly in tumor metastasis, lymphedema and inflammation, has increased interest in this vessel type, for so long overshadowed by its blood vascular cousin. VEGF-C (Vascular Endothelial Growth Factor C) and its receptor VEGFR-3 are essential for the development and maintenance of embryonic lymphatic vasculature. Furthermore, VEGF-C has been shown to be upregulated in many tumors and its expression found to positively correlate with lymphatic metastasis. Mutations in the transcription factor FOXC2 result in lymphedema-distichiasis (LD), which suggests a role for FOXC2 in the regulation of lymphatic development or function. This study was undertaken to obtain more information about the role of the VEGF-C/VEGFR-3 pathway and FOXC2 in regulating lymphatic development, growth, function and survival in physiological as well as in pathological conditions. We found that the silk-like carboxyterminal propeptide is not necessary for the lymphangiogenic activity of VEGF-C, but enhances it, and that the aminoterminal propeptide mediates binding of VEGF-C to the neuropilin-2 coreceptor, which we suggest to be involved in VEGF-C signalling via VEGFR-3. Furthermore, we found that overexpression of VEGF-C increases tumor lymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth, both of which could be inhibited by a soluble form of VEGFR-3. These results suggest that blocking VEGFR-3 signalling could be used for prevention of lymphatic tumor metastasis. This might prove to be a safe treatment method for human cancer patients, since inhibition of VEGFR-3 activity had no effect on the normal lymphatic vasculature in adult mice, though it did lead to regression of lymphatic vessels in the postnatal period. Interestingly, in contrast to VEGF-C, which induces lymphangiogenesis already during embryonic development, we found that the related VEGF-D promotes lymphatic vessel growth only after birth. These results suggest, that the lymphatic vasculature undergoes postnatal maturation, which renders it independent of ligand induced VEGFR-3 signalling for survival but responsive to VEGF-D for growth. Finally, we show that FOXC2 is necessary for the later stages of lymphatic development by regulating the morphogenesis of lymphatic valves, as well as interactions of the lymphatic endothelium with vascular mural cells, in which it cooperates with VEGFR-3. Furthermore, our study indicates that the absence of lymphatic valves, abnormal association of lymphatic capillaries with mural cells and an increased amount of basement membrane underlie the pathogenesis of LD. These findings have given new insight into the mechanisms of normal lymphatic development, as well as into the pathogenesis of diseases involving the lymphatic vasculature. They also reveal new therapeutic targets for the prevention and treatment of tumor metastasis and lymphatic vascular failure in certain forms of lymphedema. Several interesting questions were posed that still need to be addressed. Most importantly, the mechanism of VEGF-C promoted tumor metastasis and the molecular nature of the postnatal lymphatic vessel maturation remain to be elucidated.

Tutkimukseni tavoite oli selvittää imusuonten muodostumista ja toimintaa ohjaavia säätelymekanismeja etenkin sairauksissa, joissa imusuonet ovat keskeisessä osassa. Väitöskirjassani esitetyt tulokset ovat avanneet uusia näkökulmia sekä imusuonten normaaliin kehitykseen että niiden osuuteen syövän metastasoinnissa ja lymphedema-distichiasis (LD) kudosturvotussairaudessa. Uskomme havaintojemme myös mahdollistavan uusien hoitomuotojen kehittelyn syövän imusuonivälitteisen leviämisen estämiseen sekä kudosturvotuksen ehkäisemiseen LD oireyhtymässä. Imusuonet ylläpitävät kudosten nestetasapainoa, vastaavat ravintorasvojen kuljetuksesta suolistosta ja ovat oleellinen osa kehon immuunipuolustusta. Tärkeistä tehtävistään huolimatta niiden tutkimus on viime vuosiin asti jäänyt verisuonten varjoon. Tietoisuus imusuonten keskeisestä osasta syövän leviämisessä etäpesäkkeiksi ja imusuonten vajaatoiminnan johtamisesta krooniseen kudosturvotukseen, lymphedeemaan, on huomattavasti lisännyt kiinnostusta imusuonia kohtaan. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) on imusuonten kehitykselle välttämätön kasvutekijä, jonka reseptori VEGFR-3 ilmenee aikuisessa lähes yksinomaan imusuonten sisäpinnan muodostavissa endoteelisoluissa. Havaitsimme, että VEGF-C:n ilmentäminen syöpäsoluissa huomattavasti lisää imusuonten määrää kokeellisissa syöpäkasvaimissa sekä syöpäsolujen kasvua imusuonten sisällä. Nämä vaikutukset pystyimme estämään liukoisella VEGFR-3 proteiinilla. Havaitsimme myös, että vaikka hiirillä imusuonet ovat riippuvaisia VEGFR-3 signaaleista kahteen ikäviikkoon asti ja regressoituvat kun nämä estetään, aikuisessa VEGFR-3:n esto ei vaikuta normaaliin imusuonistoon. Nämä tulokset viittaavat siihen, että estämällä VEGFR-3:n toiminta voidaan turvallisesti estää syövän leviämiäminen imusuonia pitkin. Ne myös paljastavat, että imusuonet kypsyvät vasta muutamia viikkoja syntymän jälkeen. Merkittäviin syntymänjälkeisiin molekyyli- tai rakenetason muutoksiin imusuonissa viittaa myös tuloksemme, jonka mukaan VEGF-C:n kaltainen kasvutekijä VEGF-D ei aiheuta imusuonten kasvua sikiönkehityksen aikana vaan vasta syntymän jälkeen. LD on periytyvä sairaus, jonka näkyvimmät oireet ovat murrosiässä alkava alaraajojen turvotus sekä ylimääräinen, sarveiskalvoa ärsyttävä silmäripsirivistö. Löysimme LD potilaiden pienimpienkin imusuonten seinämästä normaalista poiketen runsaasti sileälihassoluja sekä lisääntyneen määrän tyvikalvoproteiineja. Näiden aikaisemmin tuntemattomien rakenteellisten muutosten arvelemme estävän nesteen pääsyä imusuoniin ja toisaalta sileälihassolujen koordinoimaton pumppausliike sekä imusuonten epätasainen seinämä ja ahtaumat ilmeisesti hankaloittavat imunesteen virtausta eteenpäin. LD oireyhtymä aiheutuu virheistä FOXC2 geenissä, joka koodaa imusuonten endoteelisolujen geenien ilmentymistä säätelevää valkuaisainetta. FOXC2 geenivirheet johtavat myös läppien puuttumisen suuremmista imusuonista, mikä puolestaan johtaa imunesteen valumiseen takaisinpäin. VEGF-C:n soveltaminen edistämään imusuonten kasvua näiden vähäisyydestä tai vahingoittumisesta johtuvan lymphedeeman hoidossa edellyttää sen ominaisuuksien täsmällistä tuntemusta. Tutkimuksissamme havaitsimme, että vaikka VEGF-C:n ainutlaatuinen, silkkiproteiinien kaltainen propeptidi ei ole välttämätön VEGF-C:n toiminnalle, se kuitenkin huomattavasti lisää VEGF-C:n kykyä aiheuttaa imusuonten kasvua. Aminoterminaalisen propeptidin puolestaan totesimme edesauttavan VEGF-C:n sitoutumista neuropiliini-2 reseptoriin, joka todennäköisesti osallistuu VEGF-C/VEGFR-3 signaalien hienosäätöön.