Molecular Modelling of Estrogen-Producing Enzymes CYP450 Aromatase and 17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1

Breast cancer is the most common cancer in women in the western countries. Approximately two-thirds of breast cancer tumours are hormone dependent, requiring estrogens to grow. Estrogens are formed in the human body via a multistep route starting from cholesterol. The final steps in the biosynthesis include the CYP450 aromatase enzyme, converting the male hormones androgens (preferred substrate androstenedione ASD) into estrogens(estrone E1), and the 17beta-HSD1 enzyme, converting the biologically less active E1 into the active hormone 17beta-hydroxyestradiol E2. E2 is bound to the nuclear estrogen receptors causing a cascade of biochemical reactions leading to cell proliferation in normal tissue, and to tumour growth in cancer tissue. Aromatase and 17beta-HSD1 are expressed in or near the breast tumour, locally providing the tissue with estrogens. One approach in treating hormone dependent breast tumours is to block the local estrogen production by inhibiting these two enzymes. Aromatase inhibitors are already on the market in treating breast cancer, despite the lack of an experimentally solved structure. The structure of 17beta-HSD1, on the other hand, has been solved, but no commercial drugs have emerged from the drug discovery projects reported in the literature. Computer-assisted molecular modelling is an invaluable tool in modern drug design projects. Modelling techniques can be used to generate a model of the target protein and to design novel inhibitors for them even if the target protein structure is unknown. Molecular modelling has applications in predicting the activities of theoretical inhibitors and in finding possible active inhibitors from a compound database. Inhibitor binding at atomic level can also be studied with molecular modelling. To clarify the interactions between the aromatase enzyme and its substrate and inhibitors, we generated a homology model based on a mammalian CYP450 enzyme, rabbit progesterone 21-hydroxylase CYP2C5. The model was carefully validated using molecular dynamics simulations (MDS) with and without the natural substrate ASD. Binding orientation of the inhibitors was based on the hypothesis that the inhibitors coordinate to the heme iron, and were studied using MDS. The inhibitors were dietary phytoestrogens, which have been shown to reduce the risk for breast cancer. To further validate the model, the interactions of a commercial breast cancer drug were studied with MDS and ligand–protein docking. In the case of 17beta-HSD1, a 3D QSAR model was generated on the basis of MDS of an enzyme complex with active inhibitor and ligand–protein docking, employing a compound library synthesised in our laboratory. Furthermore, four pharmacophore hypotheses with and without a bound substrate or an inhibitor were developed and used in screening a commercial database of drug-like compounds. The homology model of aromatase showed stable behaviour in MDS and was capable of explaining most of the results from mutagenesis studies. We were able to identify the active site residues contributing to the inhibitor binding, and explain differences in coordination geometry corresponding to the inhibitory activity. Interactions between the inhibitors and aromatase were in agreement with the mutagenesis studies reported for aromatase. Simulations of 17beta-HSD1 with inhibitors revealed an inhibitor binding mode with hydrogen bond interactions previously not reported, and a hydrophobic pocket capable of accommodating a bulky side chain. Pharmacophore hypothesis generation, followed by virtual screening, was able to identify several compounds that can be used in lead compound generation. The visualisation of the interaction fields from the QSAR model and the pharmacophores provided us with novel ideas for inhibitor development in our drug discovery project.

Länsimaissa rintasyöpä on yleisin naisilla esiintyvä syöpäsairaus. Noin kahdessa tapauksessa kolmesta kasvain on riippuvainen naishormoneista eli estrogeeneista. Estrogeenien biosynteesireitin lopussa mieshormonit eli androgeenit muuttuvat epäaktiiviseksi estrogeeniksi CYP450 aromataasi -entsyymin avulla ja epäaktiivinen estrogeeni aktiiviseksi estrogeenihormoniksi, 17beta-estradioliksi, 17beta-hydroksisteroididehydrogenaasientsyymi tyyppi 1:n (17beta-HSD1) avulla. 17beta-Estradioli sitoutuu solun tumassa olevaan estrogeenireseptoriin, joka aiheuttaa solujen jakautumisen ja syöpäkudoksessa kasvaimen kasvun. Yksi tapa hoitaa hormoniriippuvaisia syöpäkasvaimia on estää näiden entsyymien toimintaa käyttämällä entsyymi-inhibiittoreita. Inhibiittorit ovat suhteellisen pieniä yhdisteitä, jotka sitoutuvat entsyymeihin hormonien esiasteiden sijaan ja näin estävät hormonien syntymisen. Tietokoneavusteisella mallinnuksella voidaan tutkia rakenteita ja ilmiöitä, joita ei kokeellisin menetelmin voida tutkia, tai jotka ovat kalliita ja aikaavieviä. Uusien inhibiittorien suunnittelemiseksi entsyymin kolmiulotteisen rakenteen tunteminen on erittäin hyödyllistä. Aromataasientsyymin rakennetta ei ole kokeellisilla menetelmillä saatu selvitettyä, mutta entsyymin rakennetta ja sen toimintaa voidaan tutkia luomalla siitä malli jonkin sukulaisentsyymin avulla. Tässä työssä tehtiin aromataasimalli käyttämällä lähtökohtana jäniksestä eristettyä CYP2C5-entsyymiä, jonka rakenne on määritetty kokeellisesti. Jäniksen CYP2C5 on ainoa kokeellisesti määritetty nisäkkäästä eristetty CYP450-entsyymi, joka ottaa osaa steroidien aineenvaihduntaan. Luodun mallin rakenteen varmistamiseksi käytettiin molekyylidynamiikkasimulaatiota, joka mallintaa entsyymin luonnollista liikettä esim. vedessä. Simulaatioissa käytettiin entsyymiä sellaisenaan sekä kompleksina luonnollisen substraatin ja inhibiittorien kanssa. 17beta-HSD1:n rakenne on määritetty kokeellisilla menetelmillä. Tätä rakennetta käytettiin molekyylidynamiikkasimulaatiossa, jossa tutkittiin laboratoriossamme valmistettujen inhibiittorien sitoutumista entsyymiin. Näiden tulosten pohjalta luotiin kolmiulotteinen kvantitatiivinen rakenne-aktiivisuussuhdemalli (3D-QSAR), jonka perusteella voidaan ennustaa uusien, testaamattomien yhdisteiden aktiivisuus. Lisäksi luotiin farmakoforimalleja, jotka ovat kolmiulotteisia kuvauksia aktiivisuuden aiheuttavista vuorovaikutuksista entsyymi-inhibiittori-kompleksissa. Farmakoforimalleja voidaan käyttää etsittäessä uusia mahdollisia lääkeaineita suurista yhdistetietokannoista. Kehittämämme aromataasimalli oli simulaatioissa vakaa ja sen rakenne vastasi CYP450-entsyymien yleistä rakennetta. Mallin avulla voitiin selittää suurin osa mutageenitutkimusten tuloksista. Lisäksi määritimme entsyymin vuorovaikutuksia inhibiittorien kanssa ja löysimme tekijät, jotka aiheuttavat eroja eri inhibiittorien aktiivisuuksien välillä. Saavuttamamme tulokset tarjoavat erinomaisen lähtökohdan uusien inhibiittorien suunnitteluun, ja inhibiittori-entsyymi -kompleksin vuorovaikutusten tutkimiseen. 17beta-HSD1:n kohdalla selvitimme sitoutumistavan laboratoriossamme valmistetuille inhibiittoreille. Löysimme vuorovaikutuksia, joita ei ennen ole havaittu. Uuden sitoutumistavan perusteella loimme 3D-QSAR -mallin, jonka perusteella samankaltaisten yhdisteiden aktiivisuus voidaan ennustaa varsin tarkasti. Farmakoforien käyttäminen uusien yhdisteiden etsimiseen tuotti joukon yhdisteitä, joita voidaan käyttää lääkeainekehitystyön pohjana. Tuloksemme aromataasientsyymin ja 17beta-HSD1:n mallinnuksesta tuovat arvokasta uutta tietoa steroidihormonien tutkimukseen ja auttavat tutkijoita kehittämään uusia mahdollisia lääkeaineita rintasyövän ehkäisemiseksi.