L-rhamnose-1-dehydrogenase gene and L-rhamnose catabolism in the yeast Pichia stipitis

The purpose of this work was to identify some of the genes of the catabolic route of L-rhamnose in the yeast Pichia stipitis. There are at least two distinctly different pathways for L-rhamnose catabolism. The one described in bacteria has phosphorylated intermediates and the enzymes and the genes of this route have been described. The pathway described in yeast does not have phosphorylated intermediates. The intermediates and the enzymes of this pathway are known but none of the genes have been identified. The work was started by purifying the L-rhamnose dehydrogenase, which oxidates L-rhamnose to rhamnonic acid-gamma-lactone. NAD is used as a cofactor in this reaction. A DEAE ion exchange column was used for purification. The active fraction was further purified using a non-denaturing PAGE and the active protein identified by zymogram staining. In the last step the protein was separated in a SDS-PAGE, the protein band trypsinated and analysed by MALDI-TOF MS. This resulted in the identification of the corresponding gene, RHA1, which was then, after a codon change, expressed in Saccharomyces cerevisiae. Also C- or N-terminal histidine tags were added but as the activity of the enzyme was lost or strongly reduced these were not used. The kinetic properties of the protein were analysed in the cell extract. Substrate specifity was tested with different sugars; L-rhamnose, L-lyxose and L-mannose were oxidated by the enzyme. Vmax values were 180 nkat/mg, 160 nkat/mg and 72 nkat/mg, respectively. The highest affinity was towards L-rhamnose, the Km value being 0.9 mM. Lower affinities were obtained with L-lyxose, Km 4.3 mM, and L-mannose Km 25 mM. Northern analysis was done to study the transcription of RHA1 with different carbon sources. Transcription was observed only on L-rhamnose suggesting that RHA1 expression is L-rhamnose induced. A RHA1 deletion cassette for P. stipitis was constructed but the cassette had integrated randomly and not targeted to delete the RHA1 gene. Enzyme assays for L-lactaldehyde dehydrogenase were done similarly to L-rhamnose dehydrogenase assays. NAD is used as a cofactor also in this reaction where L-lactaldehyde is oxidised to L-lactate. The observed enzyme activities were very low and the activity was lost during the purification procedures.

Työn tarkoitus oli identifioida L-ramnoosin kataboliareitin geenejä Pichia stipitis hiivassa. Toistaiseksi on löydetty kaksi erilaista L-ramnoosin kataboliareittiä. Bakteereilla esiintyvässä reitissä on fosforyloidut välituotteet. Tämän reitin entsyymit ja niitä koodaavat geenit on kuvattu. Sienillä L-ramnoosin katabolireitin tuotteet ovat fosforyloimattomia. Reitin välituotteet ja entsyymit on kuvattu, mutta yhtään entsyymiä koodaavaa geeniä ei ole identifioitu. Työ aloitettiin puhdistamalla L-ramnoosidehydrogenaasi, joka katalysoi L-ramnoosin hapettumista ramnonihappo-gamma-laktoniksi. NAD toimii reaktiossa kofaktorina. DEAE-ioninvaihtopylvästä käytettiin entsyymin puhdistukseen. Aktiiviset osat ajettiin ei-denaturoivassa PAGE-geelissä ja zymogram-värjättiin. Proteiini ajettiin SDS-PAGE –geelissä ja trypsinoitiin. Aminohapposekvenssin analysointi tehtiin MALDI-TOF MS laitteella ja vastaava DNA-sekvenssi nimettiin RHA1-geeniksi. Kodoninvaihdon jälkeen RHA1 ekspressoitiin Saccharomyces cerevisiae –hiivassa. Proteiinin C- ja N-terminaalisiin päihin lisättiin histidiiniketjut, mutta seurauksena entsyymin aktiivisuus joko katosi tai väheni voimakkaasti. Proteiinin kineettiset ominaisuudet analysoitiin solu-uutteesta. Substraattispesifisyyttä testattiin eri sokereilla. L-Ramnoosin, L-lyksoosin ja L-mannoosin todettiin hapettuvan entsyymin vaikutuksesta. Vmax arvot olivat vastaavassa järjestyksessä 180 nkat/mg, 160 nkat/mg ja 72 nkat/mg. Suurin affiniteetti oli L-ramnoosilla, jonka Km arvo oli 0.9 mM. L-Lyksoosin Km arvo oli 4.3 mM ja L-mannoosin Km arvo oli 25 mM. Northernanalyysilla tutkittiin eri sokerien vaikutusta RHA1:n transkriptioon. Transkriptiota havaittiin vain L-ramnoosilla, joten RHA1:n ekspressio on L-ramnoosin indusoimaa. P. stipitis –hiivalle tehtiin RHA1-deleetiokasetti, mutta sen todettiin integroituneen sattumanvaraisesti eikä se kohdistunut oikein, joten RHA1-geenin deleetio epäonnistui. L-Laktaldehydidehydrogenaasin entsyymianalyysi tehtiin samoin kuin L-ramnoosidehydrogenaasin entsyymianalyysi. NAD toimii kofaktorina myös tässä reaktiossa, jossa L-laktaldehydi hapetetaan L-laktaatiksi. Havaitut entsyymiaktiivisuudet olivat kuitenkin hyvin alhaisia, ja entsyymi inaktivoitui puhdistusprosessissa.