Genetic diversity and microcystin production by Anabaena in the Gulf of Finland, Baltic Sea

Syanobakteerit (sinilevät) ovat olleet Itämeressä koko nykymuotoisen Itämeren ajan, sillä paleolimnologiset todisteet niiden olemassaolosta Itämeren alueella ovat noin 7000 vuoden takaa. Syanobakteerien massaesiintymät eli kukinnat ovat kuitenkin sekä levinneet laajemmille alueille että tulleet voimakkaimmiksi viimeisten vuosikymmenien aikana. Tähän on osasyynä ihmisten aiheuttama kuormitus, joka rehevöittää Itämerta. Suomenlahti, jota tämä tutkimus käsittelee, on kärsinyt tästä rehevöitymiskehityksestä muita Itämeren altaita enemmän. Syanobakteerit muodostavat jokakesäisiä kukintoja Suomenlahdella - niin sen avomerialueilla kuin rannoillakin. Yleisimmät kukintoja muodostavat syanobakteerisuvut ovat Nodularia, Anabaena ja Aphanizomenon. Kukinnat aiheuttavat paitsi esteettistä haittaa myös terveydellisen riskitekijän. Niiden myrkyllisyys liitetään usein Nodularia-suvun tuottamaan nodulariini-maksamyrkkyyn. Itämeren Aphanizomenon-suvun on todettu olevan myrkytön. Vaikka Itämeren kukintoja aiheuttavista Nodularia- ja Aphanizomenon-syanobakteereista tiedetään varsin paljon, on molekyylimenetelmiin pohjautuva syanobakteeritutkimus ohittanut Itämeren Anabaena-suvun monelta osin. Tämän työn tarkoituksena oli syventää käsitystämme Itämeren Anabaena-syanobakteerista, sen mahdollisesta myrkyllisyydestä, geneettisestä monimuotoisuudesta ja fylogeneettisista sukulaisuussuhteista. Tässä työssä eristettiin 49 planktista Anabaena-kantaa, joista viisi tuottivat mikrokystiinejä. Tämä oli ensimmäinen yksiselitteinen todiste, että Itämeren Anabaena tuottaa maksamyrkyllisiä mikrokystiini-yhdisteitä. Jokainen eristetty myrkyllinen Anabaena-kanta tuotti useita mikrokystiini-variantteja. Lisäksi mikrokystiinejä löydettiin kukintanäytteistä, joissa oli myrkkyä syntetisoivia geenejä sisältäneitä Anabaena-syanobakteereita. Myrkkyjä löydettiin molempina tutkimusvuosina 2003 ja 2004. Myrkkyjen esiintyminen ei siten ollut vain yksittäinen ilmiö. Tässä työssä saimme viitteitä siitä, että maksamyrkyllinen Anabaena-syanobakteeri esiintyisi vähäsuolaisissa vesissä. Tämä riippuvuussuhde jää kuitenkin tulevien tutkimuksien selvitettäväksi. Tässä työssä havaittiin mikrokystiinisyntetaasi-geenien inaktivoituminen Itämeren Anabaena-kannassa ja kukintanäytteissä. Kuvasimme Anabaena-kannan mikrokystiinisyntetaasigeenien sisältä insertioita, jotka hyvin todennäköisesti inaktivoivat myrkyntuoton. Insertion sisältäneeltä kannalta löysimme kuitenkin kaikki mikrokystiinisyntetaasigeenit osoittaen, että geenien olemassaolo ei välttämättä varmista kannan mikrokystiinintuottoa. Mielenkiintoista oli se, että inaktivaation aiheuttavia insertioita löytyi kukintanäytteistä molemmilta tutkimusvuosilta. Vastaavia insertioita ei kuitenkaan löydetty makean veden Anabaena-kannoista tai järvinäytteistä. On yleistä, että syanobakteerikukinnoista löytyy usean syanobakteerisuvun edustajia. Myrkyllisiä sukuja tai lajeja ei voida kuitenkaan erottaa mikroskooppisesti myrkyttömistä. Käsillä olevassa tutkimuksessa kehitettiin molekyylimenetelmä, jolla on mahdollista määrittää kukinnan mahdollisesti maksamyrkylliset syanobakteerisuvut. Tätä menetelmää sovellettiin Itämeren kukintojen tutkimiseen. Itämeren pintavesistä ja ranta-alueiden pohjasta eristetyt Anabaena-kannat osoittautuivat geneettisesti monimuotoisiksi. Tämä Anabaena-syanobakteerien geneettinen monimuotoisuus vahvistettiin monistamalla geenejä suoraan kukintanäytteistä ilman kantojen eristystä. Makeiden vesien ja Itämeren Anabaena-kannat ovat geneettisesti hyvin samankaltaisia. Geneettisissä vertailuissa kävi kuitenkin ilmi, että pohjassa elävien Anabaena-kantojen geneettinen monimuotoisuus oli suurempaa kuin pintavesistä eristettyjen kantojen. Itämeren Anabaena-kantojen sekvenssit muodostivat omia ryhmiä sukupuun sisällä, jolloin on mahdollista, että nämä edustavat Itämeren omia Anabaena-ekotyyppejä. Tämä tutkimus oli ensimmäinen, jossa uusin molekyylimenetelmin systemaattisesti selvitettiin Itämeren Anabaena-syanobakteerin geneettistä populaatiorakennetta, fylogeniaa ja myrkyntuottoa. Tulevaisuudessa monitorointitutkimuksissa on otettava huomioon myös Itämeren Anabaena-syanobakteerin mahdollinen maksamyrkyntuotto – erityisesti vähäsuolaisemmilla rannikkovesillä.

Cyanobacteria (blue-green algae) form blooms in the Baltic Sea during the warmest summer months. According to paleolimnological data, cyanobacteria have long history in the Baltic Sea, going back at least 7000 years. However, the intensity as well as the expanse of cyanobacterial blooms has increased during recent decades. Blooms attract regular attention in the media because of their visibility and the potential health risk they pose to humans and animals. The Gulf of Finland is the most eutrophied area of the Baltic Sea, and cyanobacterial blooms are widely believed to be the result of intense anthropogenic nutrient loading. Cyanobacterial blooms are formed mainly by species of three genera in the Baltic Sea, Nodularia, Anabaena and Aphanizomenon. The focus of present-day research on Baltic Sea cyanobacteria has been on Nodularia and Aphanizomenon, while the genus Anabaena has been neglected. Anabaena is often considered to play a minor role in cyanobacterial blooms. However, Anabaena can form a significant part of the blooms, especially in the northern part of the Baltic Sea. Cyanobacterial blooms in the Baltic Sea are invariably toxic due to the production of hepatotoxic nodularin by Nodularia spumigena. According to systematic studies, Aphanizomenon flos-aquae was not found to produce hepatotoxins in the Baltic Sea. However, it has been speculated that Baltic Sea Anabaena spp. could produce microcystins. The genetic structure of the Anabaena populations in the Baltic Sea has not been systematically explored. The aim of this present study was to increase our understanding of the Anabaena - a component of the Baltic Sea phytoplankton. Altogether, 49 planktonic Anabaena strains were isolated from the Gulf of Finland, five of which were microcystin-producing. This study provided unequivocal evidence that Baltic Sea Anabaena is able to produce microcystins. Each microcystin-producing Anabaena strain produced two to four dominant microcystin variants, including the highly toxic microcystin-LR. In this study, a culture-independent method was designed to detect putative microcystin and nodularin producers. By means of this DGGE method, microcystin-producing Anabaena populations were detected in cyanobacterial bloom samples from the summers of 2003 and 2004. Microcystin-producing Anabaena populations were detected throughout the Gulf of Finland. This excluded the possibility that the presence of microcystin-producing Anabaena was a chance phenomenon. Results suggest that salinity may limit the distribution of the microcystin-producing Anabaena although further studies are needed to confirm the interdependence of salinity and microcystin production. Microcystin-producing Anabaena populations were found to be highly diverse on analyses of the 16S rRNA, rbcL, rpoC1, and mcyE gene sequences. In previous studies, freshwater microcystin-producing Anabaena strains were grouped together in phylogenetic analyses. All microcystin-producing Baltic Sea Anabaena strains belonged to this hepatotoxic cluster, with the exception of a single strain. Both planktonic and benthic Anabaena populations were genetically heterogeneous and closely related to freshwater Anabaena strains. However, genetic diversity in benthic Anabaena strains was higher than in planktonic strains. In phylogenetic analyses, novel Anabaena lineages, possibly specific to the Baltic Sea, were identified. This suggests ecotypic diversification within Anabaena populations. We found two planktonic Anabaena strains which carried the entire mcy gene cluster, but were nonetheless incapable of producing microcystins. Natural genetic inactivation of the mcy gene cluster was identified in Anabaena strain BIR259. This strain carried insertions which most likely caused the inactivation of the mcy genes. The insertions documented here were surprisingly common in the Baltic Sea bloom samples and they were present in samples from both studied summers, 2003 and 2004. However, these insertions were not identified in freshwater strains or in field samples from freshwater lakes. The aim of this study was to establish a strain collection of Baltic Sea Anabaena and to shed light on the phylogeny, microcystin-production, and genetic diversity of the Baltic Sea Anabaena populations. In addition to strain isolation, these research goals were approached by in situ molecular methods. Systematic toxin screening showed that Anabaena is able to produce microcystins, and this should be taken into account in future toxin monitoring programmes.