Assessment and control of Bacillus cereus emetic toxin in food

Despite of improving levels of hygiene, the incidence of registered food borne disease has been at the same level for many years: there were 40 to 90 epidemics in which 1000-9000 persons contracted food poisoning through food or drinking water in Finland. Until the year 2004 salmonella and campylobacter were the most common bacterial causes of food borne diseases, but in years 2005-2006 Bacillus cereus was the most common. Similar developement has been published i.e. in Germany already in the 1990´s. One reason for this can be Bacillus cereus and its emetic toxin, cereulide. Bacillus cereus is a common environmental bacterium that contaminates raw materials of food. Otherwise than salmonella and campylobacter, Bacillus cereus is a heat resistant bacterium, capable of surviving most cooking procedures due to the production of highly thermo resistant spores. The food involved has usually been heat treated and surviving spores are the source of the food poisoning. The heat treatment induces germination of the spore and the vegetative cells then produce toxins. This doctoral thesis research focuses on developing methods for assessing and eliminating risks to food safety by cereulide producing Bacillus cereus. The biochemistry and physiology of cereulide production was investigated and the results were targeted to offer tools for minimizing toxin risk in food during the production. I developed methods for the extraction and quantitative analysis of cereulide directly from food. A prerequisite for that is knowledge of the chemical and physical properties of the toxin. Because cereulide is practically insoluble in water, I used organic solvents; methanol, ethanol and pentane for the extraction. For extraction of bakery products I used high temperature (100C) and pressure (103.4 bars). Alternaties for effective extraction is to flood the plain food with ethanol, followed by stationary equilibration at room temperature. I used this protocol for extracting cereulide from potato puree and penne. Using this extraction method it is also possible also extract cereulide from liquid food, like milk. These extraction methods are important improvement steps for studying of Bacillus cereus emetic food poisonings. Prior my work, cereulide extraction was done using water. As the result, the yield was poor and variable. To investigate suspected food poisonings, it is important to show actual toxicity of the incriminated food. Many toxins, but not cereulide, inactivate during food processing like heating. The next step is to identify toxin by chemical methods. I developed with my colleague Maria Andesson a rapid assay for the detection of cereulide toxicity, within 5 to 15 minutes. By applying this test it is possible to rapidly detect which food was causing the food poisoning. The chemical identification of cereulide was achieved using mass spectrometry. I used cereulide specific molecular ions, m/z (+/-0.3) 1153.8 (M+H+), 1171.0 (M+NH4+), 1176.0 (M+Na+) and 1191.7 (M+K+) for reliable identification. I investigated foods to find out their amenability to accumulate cereulide. Cereulide was formed high amounts (0.3 to 5.5 microg/g wet wt) when of cereulide producing B. cereus strains were present in beans, rice, rice-pastry and meat-pastry, if stored at non refrigerated temperatures (21-23C). Rice and meat pastries are frequently consumed under conditions where no cooled storage is available e.g. picnics and outdoor events. Bacillus cereus is a ubiquitous spore former and is therefore difficult to eliminate from foods. It is therefore important to know which conditions will affect the formation of cereulide in foods. My research showed that the cereulide content was strongly (10 to 1000 fold differences in toxin content) affected by the growth environment of the bacterium. Storage of foods under nitrogen atmosphere (> 99.5 %) prevented the production of cereulide. But when also carbon dioxide was present, minimizing the oxygen contant (< 1%) did not protect the food from formation of cereulide in preliminary experiments. Also food supplements affected cereulide production at least in the laboratory. Adding free amino acids, leucine and valine, stimulated cereulide production 10 to 20 fold. In peptide bonded form these amino acids are natural constituents in all proteins. Interestingly, adding peptide bonded leucine and valine had no significant effect on cereulide production. Free amino acids leucine and valine are approved food supplements and widely used as flawour modifiers in food technology. My research showed that these food supplements may increase food poisoning risk even though they are not toxic themselves.

Suomessa rekisteröityjen ruokamyrkytysepidemioiden määrä on vaihdellut samoissa luvuissa rekistereiden koko pitoajan, 40-90 epidemiaa ja 1000-9000 ruoasta tai juomavedestä sairastunutta henkilöä vuosittain. Näin siitä huolimatta että hygienian keinot, mm. kylmäketju on tuona aikana parantunut. Vuoteen 2004 saakka salmonella ja sitten kampylobakteeri olivat bakteeriepidemioiden pääasialliset aiheuttajat, mutta viime vuosina 2005 2006 Bacillus cereus nousi yleisimmäksi. Samantapainen kehitys alkoi mm. Saksassa jo 1990 luvulla. Yksi syy tähän kehitykseen saattaa olla Bacillus cereuksen tuottaman oksetustautia aiheuttava toksiini, kereulidi. Bacillus cereus on luonnossa ja elintarvikkeiden raaka-aineissa hyvin yleinen bakteeri. Toisin kuin salmonellat ja kampylobakteerit, se tuottaa itiöitä jotka kestävät pastöroinnin ja keittämisen sekä toksiinia joka kestää jopa höyryautoklavoinnin. Bacillus cereus itiöt aiheuttavat ruokamyrkytysriskin kuumennetuissa elintarvikkeissa ja ruoissa joita ei syödä valmistuspäivänä, koska ruoan jäähtyessä itiöt muuttuvat kasvullisiksi bakteerisoluiksi ja voivat tuottaa toksiineja. Tämän väitöskirjatyön aihe oli kereulidi ja sitä tuottavien Bacillus cereus kantojen tunnistaminen, mittaaminen ja kereulidin tuottoon vaikuttavat tekijät. Kehitin menetelmiä kereulidin mittaamiseksi suoraan elintarvikkeesta. Määrittämisen edellytys oli toksiinin kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien tuntemus, jotta saatoin suunnitella menetelmän toksiinin tehokkaaseen eristämiseen elintarvikkeesta ja raaka-aineesta. Koska kereulidi ei liukene lainkaan veteen, käytin uuttokemikaalina orgaanisia liuottimia, metanolia, etanolia ja pentaania. Leipomo- ja konditoriatuotteista uutin kereulidin korkeassa lämpötilassa (100C) ja paineessa (103.4 Bar). Vaihtoehtoisesti uutto voidaan suorittaa kuivattamalla elintarvike ja uuttamalla sitä elintarvikkeen tilavuuteen nähden kaksinkertaisessa pitoisuudessa etanolia noin 12 tuntia. Tätä menetelmää käytin mm. pastalle ja perunasoseelle. Nestemäiset elintarvikkeet, kuten maito, voidaan uuttaa pentaaniin tai kuivattaa ja suorittaa etanoliuutto. Nämä uuttomenetelmät ovat tärkeä parannus kereulidin aiheuttaman ruokamyrkytysriskin tutkimukselle, sillä ennen kereulidi uutettiin niin tuottajabakteerista kuin elintarvikkeestakin veteen jolloin kereulidi saanto oli huono ja vaihteleva riippuen elintarvikkeen rasvaisuudesta. Kun mikrobin aiheuttamaksi epäiltyä ruokamyrkytystä selvitetään, pitää osata todeta kaksi asiaa. Ensimmäiseksi epäillyn elintarvikkeen todellinen myrkyllisyys. Monet mikrobimyrkyt, vaikkakaan ei kereulidi, inaktivoituvat elintarvikkeen käsittelyprosessin aikana esimerkiksi kuumentaessa tai hapottamalla etikalla. Toiseksi myrkyn kemiallinen tunnistaminen. Siis onko kyseessä kereulidi vai jokin muu lämpökestoinen aine, esim. homemyrkky eli mykotoksiini. Tämä tieto tarvitaan myrkyn alkuperän tehokkaaseen selvittämiseen. Myrkyllisyyden toteamiseen kehitin työtoverini Maria Anderssonin kanssa pikamenetelmän, jonka avulla kereulidi voidaan todeta 5-15 minuutissa. Kehittämällämme testillä voidaan nopeasti todeta mikä mahdollisista monista elintarvikkeista oli myrkyllisyyden aiheuttaja ja siten ehkäistä lisäsairastumisia. Myrkyn tunnistaminen kereulidiksi tapahtuu massaspektrometrisesti. Osoitin että kun tämä tehdään käyttäen kereulidin molekyylijonien massalukuja: m/z (+/- 0.3) 1153.8 (M+H+), 1171.0 (M+NH4+), 1176.0 (M+Na+) ja 1191.7 (M+K+), tunnistus on aukoton. Mikäli tuotetta ei säilytetä kylmässä ja myrkkyä tuottava bakteeri on läsnä niin mm. retkieväinä käytetyissä liha- ja karjalanpiirakoissa muodostuu yleisen myyntiajan puitteissa sairastumisen aiheuttavia määriä, 0.3 5.5 microg kereulidia grammassa elintarviketta. Koska Bacillus cereuksen esiintyminen on niin yleistä, ettei siitä ole mahdollista päästä täysin eroon, on tärkeää tietää mitkä olosuhteet käynnistävät toksiinin tuoton. Tutkimuksissani selvisi että kereulidin tuotto voi vaihdella 10 1000 kertaisesti, olosuhteista riippuen. Kun elintarvike oli suljettuna astiaan, jonka kaasutila sisälsi vain typpikaasua (99.5 %), kereulidia ei muodostunut. Sen sijaan jos läsnä oli myös hiilidioksidia, kereulidia muodostui, vaikka happea oli vain alle 1 %. Myös lisä-aineilla oli vaikutusta kereulidin tuottoon, ainakin laboratorio-olosuhteissa. Leusiini ja valiini moninkertaistivat kereulidin tuoton. Peptidimuodossa nämä aminohapot ovat kaikkien proteiinien luontainen ainesosa. Yllättävää oli että vapaassa muodossa kasvatusalustaan lisätty leusiini ja valiini moninkertaistivat kereulidin tuoton, mutta proteiiniin sitoutuneilla aminohapoilla ei vastaavaa vaikutusta havaittu. Sekä leusiini että valiini ovat yleisesti käytettyjä valmisruokien aromivahventeita. Tutkimustulokseni osoittavat että nämä lisäaineet voivat aiheuttaa ruokamyrkytysriskin vaikkeivat itse ole lainkaan myrkyllisiä.