Bacillus cereus spores and cereulide in food-borne illness

B. cereus is a gram-positive bacterium that possesses two different forms of life:the large, rod-shaped cells (ca. 0.002 mm by 0.004 mm) that are able to propagate and the small (0.001 mm), oval shaped spores. The spores can survive in almost any environment for up to centuries without nourishment or water. They are insensitive towards most agents that normally kill bacteria: heating up to several hours at 90 ºC, radiation, disinfectants and extreme alkaline (≥ pH 13) and acid (≤ pH 1) environment. The spores are highly hydrophobic and therefore make them tend to stick to all kinds of surfaces, steel, plastics and live cells. In favorable conditions the spores of B. cereus may germinate into vegetative cells capable of producing food poisoning toxins. The toxins can be heat-labile protein formed after ingestion of the contaminated food, inside the gastrointestinal tract (diarrhoeal toxins), or heat stable peptides formed in the food (emesis causing toxin, cereulide). Cereulide cannot be inactivated in foods by cooking or any other procedure applicable on food. Cereulide in consumed food causes serious illness in human, even fatalities. In this thesis, B. cereus strains originating from different kinds of foods and environments and 8 different countries were inspected for their capability of forming cereulide. Of the 1041 isolates from soil, animal feed, water, air, used bedding, grass, dung and equipment only 1.2 % were capable of producing cereulide, whereas of the 144 isolates originating from foods 24 % were cereulide producers. Cereulide was detected by two methods: by its toxicity towards mammalian cells (sperm assay) and by its peculiar chemical structure using liquid-chromatograph-mass spectrometry equipment. B. cereus is known as one of the most frequent bacteria occurring in food. Most foods contain more than one kind of B. cereus. When randomly selected 100 isolates of B. cereus from commercial infant foods (dry formulas) were tested, 11% of these produced cereulide. Considering a frequent content of 103 to 104 cfu (colony forming units) of B. cereus per gram of infant food formula (dry), it appears likely that most servings (200 ml, 30 g of the powder reconstituted with water) may contain cereulide producers. When a reconstituted infant formula was inoculated with >105 cfu of cereulide producing B. cereus per ml and left at room temperature, cereulide accumulated to food poisoning levels (> 0.1 mg of cereulide per serving) within 24 hours. Paradoxically, the amount of cereulide (per g of food) increased 10 to 50 fold when the food was diluted 4 - 15 fold with water. The amount of the produced cereulide strongly depended on the composition of the formula: most toxin was formed in formulas with cereals mixed with milk, and least toxin in formulas based on milk only. In spite of the aggressive cleaning practices executed by the modern dairy industry, certain genotypes of B. cereus appear to colonise the silos tanks. In this thesis four strategies to explain their survival of their spores in dairy silos were identified. First, high survival (log 15 min kill ≤ 1.5) in the hot alkaline (pH >13) wash liquid, used at the dairies for cleaning-in-place. Second, efficient adherence of the spores to stainless steel from cold water. Third, a cereulide producing group with spores characterized by slow germination in rich medium and well preserved viability when exposed to heating at 90 ºC. Fourth, spores capable of germinating at 8 ºC and possessing the psychrotolerance gene, cspA. There were indications that spores highly resistant to hot 1% sodium hydroxide may be effectively inactivated by hot 0.9% nitric acid. Eight out of the 14 dairy silo tank isolates possessing hot alkali resistant spores were capable of germinating and forming biofilm in whole milk, not previously reported for B. cereus. In this thesis it was shown that cereulide producing B. cereus was capable of inhibiting the growth of cereulide non-producing B. cereus occurring in the same food. This phenomenon, called antagonism, has long been known to exist between B. cereus and other microbial species, e.g. various species of Bacillus, gram-negative bacteria and plant pathogenic fungi. In this thesis intra-species antagonism of B. cereus was shown for the first time. This brother-killing did not depend on the cereulide molecule, also some of the cereulide non-producers were potent antagonists. Interestingly, the antagonistic clades were most frequently found in isolates from food implicated with human illness. The antagonistic property was therefore proposed in this thesis as a novel virulence factor that increases the human morbidity of the species B. cereus, in particular of the cereulide producers.

Bacillus cereus on gram-positiivinen bakteeri, jolla on kaksi muotoa: i. sauvamainen kasvullinen solu (n. 0,002 mm × 0,004 mm), joka lisääntyy kahtia jakautumalla, ja ii. lepomuoto, pieni (0,001 mm) soikea itiö. Itiöillä on kyky säilyä ympäristössä ravinnotta ja vedettäkin elossa jopa vuosisatoja . Itiöt kestävät jokseenkin kaikkia aineita tai toimenpiteitä, joita käytetään bakteerien tappamiseen: kuumennusta 90°C lämmössä, säteilytystä, desinfiointiaineita ja sekä hapanta (pH ≤ 1) ja emäksistä ( pH ≥ 13) ympäristöä. Itiöiden pinta on rasvahakuinen (hydrofobinen) ja senvuoksi itiöt takertuvat kaikenlaisiin pintoihin, kuten teräkseen, muoveihin ja myös eläviin soluihin. Suotuisissa oloissa B. cereuksen itiöt kuoriutuvat ja kasvavat soluiksi joilla on kyky tuottaa ruokamyrkytyksiä aiheuttavia toksiineja. Osa toksiineista on lämpöherkkiä myrkyllisiä proteiineja joita muodostuu syödyn ruuan saapuessa ruuansulatuskanavaan (ripulitoksiinit). Toinen toksiinityyppi on kuumennusta kestävä peptidi, kereulidi, jota muodostuu valmiissa ruuassa tai sen aineksissa . Kereulidi on kestävä myrkky, jonka tuhoaminen ei onnistu keittämällä tai millään muullakaan ruuankäsittelymenetelmällä. Kereulidipitoisen ruuan nauttiminen aiheuttaa oksennustautia ja vakavan myrkytyksen, joka voi johtaa jopa kuolemaan. Tässä väitöskirjassa tutkittiin kereulidin tuottokykyä B. cereus kannoista, jotka oli kerätty 8 eri valtion alueelta erilaisista ruoka-aineista ja ympäristönäytteistä. 1041 bakteerikantaa kerättiin maaperästä, vesi- ja vesistönäytteistä, ilmasta, eläinten rehuista ja kuivikkeista, ruohosta, lannasta ja tuotantolaitteista. Näistä vain 1,2 % oli kereulidin tuottokykyisiä. Sensijaan niistä 144 kannasta, jotka eristettiin ruuista, 24% tuotti kereulidia. Kereulidin läsnäolon ja määrän mittaamiseen käytettiin kahta eri menetelmää: myrktllisyys nisäkässoluille (siittiötesti) ja nestekromatografia-massaspektrometria analyysiä jolla tunnistettiin kereulidin tyypillinen kemiallinen rakenne. B. cereus on yksi yleisimmistä, ellei yleisin, bakteeri nykyisissä elintarvikkeissa. Useimmista elintarvikkeista löytyy useampaa kuin yhtä B. cereuksen alalajia. 11% B. cereus kannoista, jotka eristettiin satunnaisesti valituista jauhemaisista vauvanruokavalmisteista, osoittautui kereulidin tuottajiksi. Jauhemaiset vauvanruokavalmisteet voivat sisältää 1000 .10 0000 pmy (pesäkettä muodostavaa yksikköä) B. cereus bakteeria / g . Näinollen jokainen kerta-ateria (200 ml, 30 g jauhetta veteen liuotettuna) luultavimmin sisältää myös kereulidin tuottajia. Kun 200 ml :aan steriloitua vauvanruokaa lisättiin > 100 000 pmy kereulidia tuottavaa B. cereus bakteeria ja pullo jätettiin seisomaan huoneenlämpöön 24 h, niin siihen kertyi ruokamyrkytyksen aiheuttava määrä kereulidia (> 0.1 mg). Mielenkiintoista oli, että jos vauvanruokaa laimennettiin vedellä 4 15 kertaisesti, siihen kertyi 10 50 kertaa enemmän kereulidia (g kohti) kuin laimentamattomaan. Alttius kereulidin tuottoon vaihteli valmisteesta toiseen: eniten kereulidimyrkkyä kertyi sellaisiin valmisteisiin, jotka sisälsivät sekä viljaa että maitoa, kun taas puhtaasti maitopohjaisiin valmisteisiin myrkkyä kertyi vähiten. Meijeriteollisuus käyttää järeitä menetelmiä pitääkseen prosessilaitteensa puhtaana, mutta siitä huolimatta löytyy sellaisia B. cereuksen genotyyppejä jotka pystyvät pesiytymään maitosiiloihin. Tässä väitöstyössä havaittiin, että näiden B. cereus alatyyppien itiöt olivat muita kestävämpiä prosessipesuissa käytetyille menetelmille: ne säilyivät pitkään lisääntymiskykyisinä kuumassa 1% natrium hydroksidiliuoksessa (pH > 13), tarttuivat tehokkaasti teräs- ja muihin pintoihin, pystyivät itämään kylmässä, +8°C, ja kasvamaan biofilminä maidossa. Vain harva (1.1%) maitosiilojen B. cereuksista tuotti kereulidia. Tässä väitöstyössä osoitettiin, että kereulidia tuottavat B. cereus kannat kykenivät estämään kereulidia tuottamattomien kantojen kasvun silloin, kun molempia oli samassa ruoka-aineessa. Bakteerin kykyä estää toisen bakteerin kasvua kutsutaan antagonismiksi. Pitkään tiedettiin, että B. cereus antagonoi muiden Bacillus lajien, gram-negatiivien bakteerien ja kasvipatogeenisten sienten kasvua. Tässä väitöstyössä osoitettiin ensi kertaa B. cereus-lajin sisäisen antagonismin, brother-killing (kannibalismi), olemassaolo. Myös jotkut kereulidia tuottamattomat B. cereus kannat olivat antagonistisia lajitovereilleen Tämä osoittaa, että antagonismi ei ollut kereulidin aiheuttamaa. Mielenkiintoinen oli havainto, että antagonistinen alatyyppi oli erittäin yleinen löytö ruokamyrkytystapauksissa. Näyttää siltä, että antagonistinen ominaisuus on virulenssitekijä joka tehostaa erityiseti kereulidia tuottavien B. cereus kantojen kykyä aiheuttaa ihmiselle sairautta.