Monitoring of Fungal Growth and Degradation of Wood

Valko- ja ruskolahosienet tunnetaan luonnossa tehokkaimpina puun ja karikkeen lignoselluloosan lahottajina. Valkolahosienet pystyvät hajottamaan kaikkia puun osia: ligniiniä, selluloosaa ja hemiselluloosaa. Selektiivisesti ligniiniä hajottavat sienet lahottavat puusta suhteessa enemmän vaikeasti hajoavaa ligniiniä kuin selluloosaa tai hemiselluloosaa, jolloin jäljelle jää valkoista ja miltei puhdasta selluloosaa. Bioteknisissä sovelluksissa juuri selektiviiviset valkolahottajat ovat kiinnostavia. Niiden avulla voidaan puuhaketta esikäsitellä esimerkiksi paperinvalmistuksessa haitallisen ligniinin poistamiseksi. Ruskolahosienet ovat huomattavia puun, puutavaran ja puisten rakenteiden lahottajia, kuten tässä työssä käytetty Gloeophyllum trabeum (saunasieni ) ja Poria (Postia) placenta (istukkakääpä). Ruskolahosienet hajottavat puusta hemiselluloosan lisäksi selluloosaa, jolloin jää jäljelle ruskea ja jauhomaiseksi mureneva ligniini. Ruskolahosienet muovaavat ligniiniä jonkin verran. Kahden ruskolahosienen G. trabeumin ja P. placentan lisäksi tutkittiin valkolahosieniä, joista Ceriporiopsis subvermispora (karstakääpä) ja harvinainen Physisporinus rivulosus -sieni (talikääpä) hajottavat ligniiniä erittäin selektiivisesti. Phanerochaete chrysosporium on kaikkialla paljon tutkittu sieni, ja Phlebia radiata valkolahosientä (rusorypykkä) on tutkittu paljon mikrobiologian osastolla. Lisäksi tutkittiin Phlebia tremellosa -sienten (hytyrypykkä) ligninolyyttisten entsyymien tuottoa ja 14C-leimatun synteettisen ligniinin (DHP) hajotusta. P. radiata ja P. tremellosa -sienten on todettu aiemmin hajottavan ligniiniä selektiivisesti. Työssä selvitettiin miten sienten kasvua voi mitata, miten vertailukelpoisia eri mittaamismenetelmillä saadut tulokset ovat ja ilmenevätkö sienten aktiivisimmat kasvuvaiheet samaan aikaan eri menetelmillä mitattuna. Tärkeimmät tulokset olivat seuraavat havainnot: (i) P. radiata ja P. tremellosa -sienikannat tuottivat ligniini- ja mangaaniperoksidaasientsyymejä (LiP ja MnP) sekä lakkaasia, ja sienistä puhdistettiin 2-3 LiP- ja P. radiatasta yksi MnP-entsyymi; (ii) P. tremellosa -sienet hajottivat leimattua synteettistä ligniiniä (DHP) yhtä hyvin kuin paljon tutkitut P. chrysosporium ja P. radiata -sienet; (iii) puu, sienen luonnollinen kasvualusta, lisäsi valkolaho- ja ruskolahosienten demetoksylaatiota [O14CH3]-leimatusta ligniinin malliyhdisteestä 14CO2:ksi ilman puuta olleeseen alustaan verrattuna; (iv) demetoksylaatio (14CO2:n tuotto) oli normaalissa ilma-atmosfäärissä useimmiten parempi happeen verrattuna; (v) hapessa paras 14CO2:n tuotto saatiin puupalakasvatuksissa, joihin oli lisätty ravinnetyppeä tai typen lisäksi glukoosia sekä valkolaho- että ruskolahosienillä; (vi) ilmassa 14CO2:n tuotto oli puulla voimakkainta valkolahosienillä ilman lisäravinteita, kun taas G. trabeum -sienellä se oli yhtä hyvä eri alustoissa; (vii) biomassan muodostuminen rihmastojen ergosterolipitoisuuksista mitattuna oli ruskolahosienillä parempi kuin valkolahosienillä; (viii) ja biomassojen huippupitoisuudet olivat 6:lla sienellä eri suuruisia ja niiden maksimimäärien ajankohdat vaihtelivat viiden viikon kasvatusten kuluessa. Mikrobiologian osastolla Viikissä eristetty ja paljon tutkittu P. radiata -valkolahosieni oli mukana kaikissa tehdyissä kokeissa. Sienen LiP-aktiivisuus ja 14CO2:n tuotto 14C-rengas-leimatusta synteettisestä ligniinistä (DHP) korreloivat erittäin hyvin. Biomassan muodostuminen ergosterolilla määritettynä tuki hyvin entsyymiaktiivisuusmittauksilla ja isotooppikasvatuksilla saatuja tuloksia.

In the present work the growth and activities of some basidiomycetous fungi were studied. Three approaches were used: measurements of extracellular enzyme activities (lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) and laccase), radioisotopic assays based on 14C-(ring)-labelled synthetic lignin (DHP), [O14CH3]-labelled nonphenolic β-O-4 dimer (veratrylglycerol- β-guaiacyl ether) and [O14CH3]-labelled vanillic acid, and ergosterol analysis. The radioisotopic method is one of the most reliable techniques in determining the growth and activities of fungi. Measurement of enzyme activity is another way of evaluating the biological activity of a fungus, which in turn is related to the fungal growth. Ergosterol is a good indicator of fungal growth because it is the main sterol in fungal cell membranes and is almost exclusively present in living fungi. The white-rot fungal strains of Phlebia radiata and P. tremellosa were similar, based on enzyme activities. A total of 2–3 LiPs were purified from all these strains as well as two MnPs from the P. radiata strains. All four P. tremellosa strains showed MnP activity, and both Phlebia radiata and P. tremellosa strains laccase activity. The presence of wood in the medium increased the evolution of the 14CO2 from [O14CH3]-labelled β-O-4 dimer by the white-rot fungi P. radiata and Phanerochaete chrysosporium and the brown-rot fungus Gloeophyllum trabeum especially in an air atmosphere with no nitrogen or glucose supplements. Wood also in most cases compensated for those nutrients in wood-agar cultures by fungi in both atmospheres, i.e. wood supplied nutrients to the fungi for efficient demethoxylation. An air atmosphere was at least as good as an oxygen atmosphere for demethoxylation activity of the fungi when they were grown in 14C-labelled cultures with wood blocks. The highest amount of biomass, based on an ergosterol assay, was obtained by P. radiata and P. chrysosporium in low-nutrient nitrogen (2 mM-N) medium from wood in solid agar cultures. The medium combination 2 mM-N with low glucose (0.1%) was chosen for experiments in liquid cultures, from which the ergosterol contents of six fungi were analysed weekly during five weeks. Under the same conditions as used for the white-rot fungi, the brown-rot fungi G. trabeum and Poria (Postia) placenta grew well and they indicated the highest ergosterol contents. Phlebia radiata was used in all cultures and experiments in which different methods were tested. The results showed that the lignin peroxidase activities and the radioisotopic method (the evolution of 14CO2 when 14C-labelled compounds were used as substrates) correlated very strongly. The ergosterol content also correlated well with LiP activity, but to verify the true significance of this, samples should be taken almost daily during the early stages of growth.