Evolution and detection of cyanobacterial hepatotoxin synthetase genes

Mass occurrences (blooms) of cyanobacteria are common in aquatic environments worldwide. These blooms are often toxic, due to the presence of hepatotoxins or neurotoxins. The most common cyanobacterial toxins are hepatotoxins: microcystins and nodularins. In freshwaters, the main producers of microcystins are Microcystis, Anabaena, and Planktothrix. Nodularins are produced by strains of Nodularia spumigena in brackish waters. Toxic and nontoxic strains of cyanobacteria co-occur and cannot be differentiated by conventional microscopy. Molecular biological methods based on microcystin and nodularin synthetase genes enable detection of potentially hepatotoxic cyanobacteria. In the present study, molecular detection methods for hepatotoxin-producing cyanobacteria were developed, based on microcystin synthetase gene E (mcyE) and the orthologous nodularin synthetase gene F (ndaF) sequences. General primers were designed to amplify the mcyE/ndaF gene region from microcystin-producing Anabaena, Microcystis, Planktothrix, and Nostoc, and nodularin-producing Nodularia strains. The sequences were used for phylogenetic analyses to study how cyanobacterial mcy genes have evolved. The results showed that mcy genes and microcystin are very old and were already present in the ancestor of many modern cyanobacterial genera. The results also suggested that the sporadic distribution of biosynthetic genes in modern cyanobacteria is caused by repeated gene losses in the more derived lineages of cyanobacteria and not by horizontal gene transfer. Phylogenetic analysis also proposed that nda genes evolved from mcy genes. The frequency and composition of the microcystin producers in 70 lakes in Finland were studied by conventional polymerase chain reaction (PCR). Potential microcystin producers were detected in 84% of the lakes, using general mcyE primers, and in 91% of the lakes with the three genus-specific mcyE primers. Potential microcystin-producing Microcystis were detected in 70%, Planktothrix in 63%, and Anabaena in 37% of the lakes. The presence and co-occurrence of potential microcystin producers were more frequent in eutrophic lakes, where the total phosphorus concentration was high. The PCR results could also be associated with various environmental factors by correlation and regression analyses. In these analyses, the total nitrogen concentration and pH were both associated with the presence of multiple microcystin-producing genera and partly explained the probability of occurrence of mcyE genes. In general, the results showed that higher nutrient concentrations increased the occurrence of potential microcystin producers and the risk for toxic bloom formation. Genus-specific probe pairs for microcystin-producing Anabaena, Microcystis, Planktothrix, and Nostoc, and nodularin-producing Nodularia were designed to be used in a DNA-chip assay. The DNA-chip can be used to simultaneously detect all these potential microcystin/nodularin producers in environmental water samples. The probe pairs detected the mcyE/ndaF genes specifically and sensitively when tested with cyanobacterial strains. In addition, potential microcystin/nodularin producers were identified in lake and Baltic Sea samples by the DNA-chip almost as sensitively as by quantitative real-time PCR (qPCR), which was used to validate the DNA-chip results. Further improvement of the DNA-chip assay was achieved by optimization of the PCR, the first step in the assay. Analysis of the mcy and nda gene clusters from various hepatotoxin-producing cyanobacteria was rewarding; it revealed that the genes were ancient. In addition, new methods detecting all the main producers of hepatotoxins could be developed. Interestingly, potential microcystin-producing cyanobacterial strains of Microcystis, Planktothrix, and Anabaena, co-occurred especially in eutrophic and hypertrophic lakes. Protecting waters from eutrophication and restoration of lakes may thus decrease the prevalence of toxic cyanobacteria and the frequency of toxic blooms.

Syanobakteerien massaesiintymät (kukinnat) vesistöissä ovat yleisiä kaikkialla maailmassa. Kukinnat ovat usein myrkyllisiä johtuen syanobakteerien tuottamista maksa- ja hermomyrkyistä. Yleisimmät syanobakteerien tuottamat maksamyrkyt ovat mikrokystiini ja nodulariini. Makeissa vesissä mikrokystiinejä tuottavat tavallisimmin Anabaena, Microcystis ja Planktothrix. Sen sijaan nodulariineja tuottavat vain Nodularia spumigena syanobakteerit, joita esiintyy murtovesissä. Ongelmallista on, ettei myrkkyä tuottavia syanobakteerisoluja voida erottaa myrkkyä tuottamattomista soluista mikroskoopilla katsomalla. Sen sijaan mikrokystiini- ja nodulariinisyntetaasigeeneihin perustuvat molekyylibiologiset menetelmät mahdollistavat myrkyllisten syanobakteerien tunnistamisen. Tässä työssä kehitettiin menetelmiä, jotka tunnistavat näiden maksamyrkyllisten syanobakteereiden DNA:sta yhden maksamyrkkyjen valmistukseen tarvittavan geenin osan. Aluksi suunniteltiin yleiset alukkeet, jotka tunnistivat ja monistivat tämän geenin sekä mikrokystiinejä tuottavista Anabaena-, Microcystis-, Planktothrix- ja Nostoc-sukujen syanobakteereista (mcyE-geeni) että nodulariineja tuottavista Nodularia-suvun syanobakteereista (ndaF-geeni). Monistettujen geenien avulla tutkittiin miten nämä geenit ovat kehittyneet syanobakteerien evoluution aikana. Tutkimus paljasti, että mikrokystiini- ja nodulariinisyntetaasigeenit ovat erittäin vanhoja. Tulokset tukivat myös oletusta, että mikrokystiinisyntetaasigeenit ovat periytyneet sukupolvelta toiselle eivätkä ole siirtyneet satunnaisesti solujen välillä nk. lateraalisessa geenisiirrossa. Evoluution aikana mikrokystiinisyntetaasigeenit ovat todennäköisimmin hävinneet joiltakin syanobakteereilta ja vastaavasti säilyneet muilla, mikä on johtanut siihen että näitä geenejä on vain osalla nykyisistä syanobakteereista. Sukupuuanalyysin mukaan nodulariinisyntetaasigeenit kehittyivät mikrokystiinisyntetaasigeeneistä. Tutkimme kuinka yleisiä eri sukuihin kuuluvat mikrokystiinin tuottajat olivat 70 suomalaisessa järvessä. Mahdollisia mikrokystiinin tuottajia havaittiin 84% järvistä käytettäessä yleisiä alukkeita ja 91% järvistä, kun käytettiin eri sukuja tunnistavia alukkeita. Microcystis-sukuun kuuluvia tuottajia havaittiin 70% järvistä, Planktothrix- ja Anabaena-sukuihin kuuluvia tuottajia taas 63% ja 37% järvistä. Myrkyllisten syanobakteerisukujen esiintyminen ja erityisesti usean suvun esiintyminen samanaikaisesti oli yleisempää rehevöityneimmissä järvissä. Tutkimuksessa geenimonistustuloksia myös verrattiin tilastollisesti useisiin ympäristötekijöihin. Korrelaatioanalyysi osoitti usean suvun rinnakkaisesiintyminen liittyvän mm. veden korkeaan typpipitoisuuteen. Lisäksi regressioanalyysissä typpipitoisuuden osoitettiin osaltaan selittävän mcyE-geenien ja siten myös mikrokystiinejä tuottavien syanobakteereiden esiintymistä. Tuloksista voidaan päätellä järvien korkeiden ravinnepitoisuuksien nostavan usean mikrokystiinin tuottajasuvun esiintymistodennäköisyyttä, jolloin myös myrkyllisten massaesiintymisten kehittymisen riski on suurempi rehevissä vesissä. Tutkimuksessa kehitettiin myös menetelmä, jolla kaikki vesinäytteessä olevat mikrokystiinin tai nodulariinin mahdolliset tuottajat voidaan tunnistaa yhdellä kertaa. Tätä nk. DNA-sirumenetelmää varten suunniteltiin Anabaena-, Microcystis-, Planktothrix-, Nostoc-, ja Nodularia-suvuille koetinparit, joilla niiden mcyE- tai ndaF-geenit voidaan tunnistaa. Koetinparit osoittautuivat spesifisiksi ja herkiksi, kun niitä arvioitiin syanobakteerikannoilla sekä järvi- ja Itämeri-näytteillä. DNA-siruilla pystyttiin tunnistamaan ympäristönäytteissä olevat mahdolliset maksamyrkkyjen tuottajat lähes yhtä herkästi kuin kvantitatiivisella geenimonistusanalyysillä, jota käytettiin varmentamaan DNA-sirutuloksia. Optimoimalla menetelmän geenimonistusvaihetta DNA-sirumenetelmää voitiin parantaa. Useiden eri sukuihin kuuluvien maksamyrkyllisten syanobakteerien mikrokystiini- ja nodulariinisyntetaasigeenien tutkiminen oli palkitsevaa. Geenien havaittiin olevan hyvin vanhoja. Sen lisäksi kehitettiin uusia menetelmiä, joilla voidaan tunnistaa kaikki tärkeimmät maksamyrkkyjen tuottajat. Mikrokystiiniä tuottavien Microcystis-, Planktothrix-, ja Anabaena-syanobakteerien havaittiin esiintyvän samanaikaisesti erityisesti runsasravinteisissa järvissä. Maksamyrkkyä tuottavien syanobakteerien ja siten myös myrkyllisten kukintojen esiintymistä voitaisiin mahdollisesti ehkäistä suojelemalla järviä rehevöitymiseltä ja niiden kunnostamisella.