Zinc, cadmium and lead resistance mechanisms in bacteria and their contribution to biosensing

In bacteria resistance to heavy metals is mainly achieved through active efflux, but also sequestration with proteins or as insoluble compounds is used. Although numerous studies have dealt with zinc, cadmium and lead resistance mechanisms in bacteria, it has still remained unclear how different transporters are integrated into an effective homeostasis/resistance network and whether specific mechanisms for lead sequestration exist. Furthermore, since metals are toxic not only to bacteria but to higher organisms as well, it is important to be able to estimate possible biological effects of heavy metals in the environment. This could be done by determining the bioavailable amount of the metals in the environment with bacterial bioreporters. That is, one can employ bacteria that respond to metal contamination by a measurable signal to assess the property of metals to cross biological membranes and to cause harmful effects in a possibly polluted environment. In this thesis a new lead resistance mechanism is described, interplay between CBA transporters and P-type ATPases in zinc and cadmium resistance is presented and finally the acquired knowledge is used to construct bacterial bioreporters for heavy metals with increased sensitivity and specificity. The new lead resistance model employs a P-type ATPase that removes Pb2+ ions from the cytoplasm and a phosphatase that produces inorganic phosphate for lead sequestration in the periplasm. This was the first study where the molecular mechanism of lead sequestration has been described. Characterization of two P-type ATPases and two CBA transporters showed that resistance mechanisms for Zn2+ and Cd2+ are somewhat different than for Pb2+ as these metals cannot be sequestered as insoluble compounds as easily. Resistance to Zn2+ was conferred merely by the CBA transporter that could export both cytoplasmic and periplasmic ions; whereas, full resistance to Cd2+ required interplay of a P-type ATPase that exported cytoplasmic ions to periplasm and a CBA transporter that further exported periplasmic ions to the outside. The knowledge on functionality of the transporters and metal-inducible promoters was exploited in bioreporter technology. A transporter-deficient bioreporter strain that lacked exporters for Zn2+/Cd2+/Pb2+ could detect up to 45-fold lower metal concentrations than its wild type counterpart due to the accumulation of metals in the cell. The broad specificity issue of bioreporters was overcome by using Zn-specific promoter as a sensor element, thus achieving Zn-specific bioreporter.

Bakteereiden kyky sietää raskasmetalleja perustuu tyypillisesti metalli-ionien kuljettamiseen solusta ulos, mutta bakteerit pyrkivät myös saostamaan ioneja liukenemattomina yhdisteinä raskasmetallien toksisuuden vähentämiseksi. Vaikka puolustusmekanismit sinkille, kadmiumille ja lyijylle tunnetaan pääpiirteittäin, kokonaiskuva eri mekanismien yhteistoiminnasta on vielä jäänyt epäselväksi. Biologisen perustietämyksen lisäksi solun puolustusmekanismien ja niiden säätelyn ymmärtäminen on tärkeää bioreportteriteknologian kehittämisessä. Bioreporttereilla tarkoitetaan bakteereita, jotka tuottavat mitattavaa signaalia vastauksena esimerkiksi metallin esiintymiselle niiden kasvuympäristössä. Bioreporttereita käytetään biosaatavien metallien metallien, jotka pystyvät läpäisemään solukalvoja ja vaikuttamaan haitallisesti elintoimintoihin määrittelemiseen ympäristöstä. Tässä työssä karakterisoidaan uusi lyijyresistenssimekanismi, tutkitaan erilaisten metallitransporttereiden yhteistyötä sinkin ja kadmiumin uloskuljetuksessa sekä käytettään saatua tietoa herkempien ja spesifisimpien bioreporttereiden kehittämiseen. Uudessa lyijyresistenssimallissa kuljetusproteiini siirtää lyijyionit solusta ulos ja toinen proteiini, fosfataasientsyymi, tuottaa epäorgaanista fosfaattia lyijyn saostamiseen. Kyseessä on ensimmäinen kerta, kun lyijyn saostaminen on kuvattu molekyylitasolla. Muiden kuljetusproteiinien karakterisoinnin mukaan sinkin ja kadmiumin sietokyky bakteereissa perustuu pelkästään uloskuljetukseen eikä saostukseen. Sietokyky sinkille saavutetaan kuljetuskompleksilla, joka poistaa metalli-ioneja sekä solusta että solukalvojen välistä. Kadmiumin sietokyky puolestaan vaatii kahden eri kuljetusproteiinin yhteistyötä: ensin yksi proteiini kuljettaa metalli-ionit solusta solukalvojen väliin, josta toinen kuljetusproteiinin edelleen poistaa ne kokonaan ulos solusta. Kuljetusproteiinien toiminnasta saatua tietoa sovelletaan entistä herkempien bioreporttereiden rakentamisessa. Bakteerikanta, josta oli poistettu kaikki sinkin, kadmiumin ja lyijyn kuljetusproteiinit, pystyi detektoimaan ympäristöstä 45 kertaa pienempiä metallipitoisuuksia kun villityyppibakteeri. Parempi herkkyys johtui metalli-ionien kerääntymisestä soluun, kun kaikki poistomekanismit oli kytketty pois päältä. Uusien herkempien bioreporttereiden käyttöönotto mahdollistaa biosaatavien raskasmetallien tarkemman määrittelemisen ympäristössä ja helpottaa riskianalyysia sekä remediaatiokeinojen valintaa.