Molecular biology of progressive myoclonus epilepsy of Unverricht-Lundborg type (EPM1)

Progressive myoclonus epilepsy of Unverricht-Lundborg type (EPM1) is an autosomal recessively inherited disorder characterized by age of onset at 6-15 years, stimulus-sensitive myoclonus, tonic-clonic epileptic seizures and a progressive course. Mutations in the cystatin B (CSTB) gene underlie EPM1. The most common mutation underlying EPM1 is a dodecamer repeat expansion in the promoter region of CSTB. In addition, nine other mutations have been identified. CSTB, a cysteine protease inhibitor, is a ubiquitously expressed inhibitor of cathepsins, but its physiological function is unknown. The purpose of this study was to investigate CSTB gene expression and CSTB protein function in normal and pathological conditions. The basal CSTB promoter was mapped and characterized using different promoter-luciferase gene constructs. The binding activity of transcription factors to one ARE half, five Sp1 and four AP1 sites in the CSTB promoter was demonstrated. The CSTB promoter activity was clearly decreased using a CSTB promoter with "premutation" repeat expansions and in individuals with alike expansions. The expression of CSTB mRNA and protein was markedly reduced in patient cells. The endogenous CSTB protein localized to the nucleus, cytoplasm and lysosomes, and in differentiated cells merely to the cytoplasm. This suggests that the subcellular distribution of CSTB is dependent on the differentation status of the cells. The proteins representing patient missense mutations failed to associate with lysosomes, implying the importance of the lysosomal association for the proper physiological function of CSTB. Several alternatively spliced CSTB isoforms were identified. Of these CSTB2 was widely expressed with very low levels whereas the other alternatively spliced forms seemed to have limited tissue expression. In patients CSTB2 expression was reduced similarly to that of CSTB. The physiological relevance of CSTB alternative splicing remains unknown. The mouse Cstb transcript was shown to be present in all embryonic stages and adult tissues examined. The expression was highest at embryonic day 7 and in thymus, as well as in postnatal brain in the cortex, caudate putamen, thalamus, hippocampus, and in the Purkinje cell layer of the cerebellum. Our data implies that CSTB expression is tightly temporally and spatially regulated. The data presented in my thesis lay the basis for further understanding of the role of CSTB in health and disease.

Unverricht-Lundborg-tyyppinen etenevä myoklonusepilepsia (EPM1) on peittyvästi periytyvä aivoja rappeuttava sairaus, jonka oireisiin kuuluvat epileptiset kohtaukset ja ärsykeherkät tahdottomat lihasnykäykset. Taudin oireet alkavat 6-15 vuoden iässä ja ovat eteneviä. EPM1:n taustalla ovat virheet kystatiini B (CSTB) -geenissä. Yleisin mutaatio on 12 emäksestä muodostuvan toistojakson monistuma CSTB-geenin säätelyalueella, minkä lisäksi tunnetaan yhdeksän muuta mutaatiota. CSTB-proteiini toimii tiettyjen valkuaisaineita pilkkovien entsyymien estäjänä, mutta sen tehtävää elimistössä ei tarkoin tunneta. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin normaalin CSTB-geenin ilmenemistä hiirellä ja ihmisellä, CSTB-proteiinin solulokalisaatiota sekä potilasmutaatioiden vaikutusta näihin. Kartoitimme ihmisen CSTB-geenin säätelyalueen ja osoitimme siihen paikantuvien transkriptiotekijöiden sitoutumisen. CSTB:n ilmeneminen väheni selvästi säätelyalueen sisältäessä toistojakson pidentymän sekä henkilöillä, joilla on normaalin muodon ja tautimutaation välinen muoto toistojakson pidentymästä. EPM1-potilaiden soluissa CSTB-geenin lähetti-RNA:n sekä proteiinin määrä oli merkittävästi alentunut. CSTB-proteiini paikantui jakautuvissa soluissa solunsisällä tumaan, sytoplasmaan ja lysosomeihin sekä erilaistuneissa soluissa pääasiallisesti sytoplasmaan. Potilasmutaatioiden seurauksena CSTB-proteiini menetti lokalisaation lysosomeihin. Tulosten mukaan solun erilaistumistaso vaikuttaa CSTB:n paikantumiseen ja lysosomaalinen sijainti on tarpeellinen sen oikean toiminnan kannalta. CSTB-geenissä havaittiin vaihtoehtoista silmikoitumista. CSTB2-muoto ilmeni laajasti, mutta sen osuus oli vain 0,4-4,1 % koko CSTB-geenin ilmentymisestä. Sen ilmeneminen oli alentunut potilassoluissa. Muut muodot näyttivät ilmenevän kudosspesifisesti. CSTB-geenin vaihtoehtoisen silmikoitumisen fysiologinen merkitys jäi epäselväksi. Havaitsimme hiiren Cstb-geenin ilmenevän laajasti ja olevan korkeinta 7-päivän ikäisessä sikiössä sekä kateenkorvassa. Keskushermostossa Cstb ilmeni isoaivokuorella, aivokuorukassa, talamuksessa ja hippokampuksessa, sekä pikkuaivojen Purkinje-solukerroksessa. Tulostemme perusteella CSTB ilmeneminen on voimakkaasti ajallisesti ja paikallisesti säädeltyä. Väitöskirjassani esitetyt tulokset luovat perustaa jatkotutkimuksille selvitettäessä CSTB-proteiinin normaalia toimintaa sekä sen puuttumisen ja virheellisen toiminnan merkitystä EPM1-taudin synnyssä.