Novel prognostic factors in chronic myeloid leukemia

Chronic myeloid leukemia (CML) is a malignant clonal blood disease that originates from a pluripotent hematopoietic stem cell. The cytogenetic hallmark of CML, the Philadelphia chromosome (Ph), is formed as a result of reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22, which leads to a formation of a chimeric BCR-ABL fusion gene. The BCR-ABL protein is a constitutively active tyrosine kinase that changes the adhesion properties of cells, constitutively activates mitogenic signaling, enhances cell proliferation and reduces apoptosis. This results in leukemic growth and the clinical disease, CML. With the advent of targeted therapies against the BCR-ABL fusion protein, the treatment of CML has changed considerably during the recent decade. In this thesis, the clinical significance of different diagnostic methods and new prognostic factors in CML have been assessed. First, the association between two different methods for measuring CML disease burden (the RQ-PCR and the high mitotic index metaphase FISH) was assessed in bone marrow and peripheral blood samples. The correlation between positive RQ-PCR and metaphase FISH samples was high. However, RQ-PCR was more sensitive and yielded measurable transcripts in 40% of the samples that were negative by metaphase FISH. The study established a laboratory-specific conversion factor for setting up the International Scale when standardizing RQ-PCR measurements. Secondly, the amount of minimal residual disease (MRD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT) was determined. For this, metaphase FISH was done for the bone marrow samples of 102 CML patients. Most (68%), had no residual cells during the entire follow-up time. Some (12 %) patients had minor (<1%) MRD which decreased even further with time, whereas 19% had a progressive rise in MRD that exceeded 1% or had more than 1% residual cells when first detected. Residual cells did not become eradicated spontaneously if the frequency of Ph+ cells exceeded 1% during follow-up. Next, the impact of deletions in the derivative chromosome 9, was examined. Deletions were observed in 15% of the CML patients who later received alloHSCT. After alloHSCT, there was no difference in the total relapse rate in patients with or without deletions. Nor did the estimates of overall survival, transplant-related mortality, leukemia-free survival and relapse-free time show any difference between these groups. When conventional treatment regimens are used, the der(9) status could be an important criterion, in conjunction with other prognostic factors, when allogeneic transplantation is considered. The significance of der(9) deletions for patients treated with tyrosine kinase inhibitors is not clear and requires further investigation. In addition to the der(9) status of the patient, the significance of bone marrow lymphocytosis as a prognostic factor in CML was assessed. Bone marrow lymphocytosis during imatinib therapy was a positive predictive factor and heralded optimal response. When combined with major cytogenetic response at three months of treatment, bone marrow lymphocytosis predicted a prognostically important major molecular response at 18 months of imatinib treatment. Although the validation of these findings is warranted, the determination of the bone marrow lymphocyte count could be included in the evaluation of early response to imatinib treatment already now. Finally, BCR-ABL kinase domain mutations were studied in CML patients resistant against imatinib treatment. Point mutations detected in the kinase domain were the same as previously reported, but other sequence variants, e.g. deletions or exon splicing, were also found. The clinical significance of the other variations remains to be determined.

Krooninen myelooinen leukemia (KML) on pahanlaatuinen veren kantasolujen sairaus, jolle on tyypillistä luuytimen lisääntynyt granulosyyttisarjan valkosolujen tuotanto. KML:n tunnusmerkki on fuusiogeeni BCR-ABL, joka on muodostunut kromosomien 9 ja 22 välisen translokaation eli siirtymän seurauksena (Philadelphia-kromosomi). BCR-ABL-onkogeeni tuottaa jatkuvasti aktiivisessa muodossa olevaa tyrosiinikinaasientsyymiä, joka aktivoi useita solusignaalivälitysteitä ja johtaa poikkeavuuksiin solusyklin, adheesion ja apoptoosin säätelyssä. KML:n molekyylitason patogeneesi on hyvin tunnettu ja sen seurauksena on kehitetty ensimmäinen syövän täsmähoito, imatinibi. Lähes kaikkien uusien potilaiden hoito aloitetaan imatinibillä, ja yksin tällä lääkityksellä n. 75% potilaista saa täyden sytogeneettisen vasteen 12-18 kuukauden kuluessa. Herkillä seurantamenetelmillä voidaan kuitenkin lähes kaikilla potilailla todeta leukeemisia jäännössoluja. Allogeeninen kantasolujensiirto on KML:n parantava hoito, johon kuitenkin liittyy 20 %:n kuolleisuus. Viime vuosien keskeinen kysymys KML:n hoidossa onkin ollut hoidon valinta: milloin tulee edetä välittömästi kantasolujensiirtoon ja milloin voidaan tautia seurata ainoastaan imatinibihoidolla. Hyviä kriteereitä ei ole, koska KML:n hoitovastetta ja taudinkulkua ei tällä hetkellä voida ennustaa. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia geeni- ym. muutoksia, jotka mahdollisimman varhain ennustaisivat taudin kulkua ja vastetta sekä lääkehoitoon, että kantasolujensiirtoon. Sytomolekyyligeneettisiä (ns. metafaasi-FISH -menetelmä) ja molekyyligeneettisiä (ns. RQ-PCR-tekniikka) seurantamenetelmiä vertailevassa tutkimuksessa arvioitiin näiden menetelmien herkkyyttä ja keskinäistä yhteneväisyyttä havaita leukeemisia jäännössoluja luuydin- ja verinäytteistä. Eri menetelmillä saatujen tulosten välinen korrelaatio oli hyvä. Erityisesti luuydinnäytteistä tehtyjen FISH- ja RQ-PCR-tutkimusten sekä veri- ja luuydinnäytteistä tehtyjen RQ-PCR-tutkimusten tulokset korreloivat hyvin toisiinsa. RQ-PCR-tutkimukset olivat kuitenkin FISH-tutkimuksia herkempiä vähäisen jäännöstaudin osoittamisessa. Tämän päivän RQ-PCR-tutkimusten tavoitteena on standardisoida menetelmät siten, että eri laboratorioissa tuotetut RQ-PCR-tutkimustulokset olisivat kansainvälisesti keskenään vertailtavissa ns. kansainvälisellä asteikolla (International Scale, IS). Työssä esitettiin lisäksi malli muuntaa laboratoriossa saatavat RQ-PCR-tulokset tälle asteikolle. Allogeenisen kantasolujensiirron jälkeen todettavien leukeemisten Philadelphia-kromosomipositiivisten jäännössolujen merkitystä KML-potilaan ennusteelle tutkittiin yli sadan potilaan aineistossa. Tutkimuksessa todettiin, että poikkeavien jäännössolujen osuuden nouseva suuntaus tai yhden prosentin määrä jäännössoluja oli tässä potilasaineistossa raja, jota suuremmat solumäärät eivät hävinneet potilaan luuytimestä ilman poikkeavat solut eivät hävinneet ilman hoitotoimenpiteitä. Tutkimustuloksia voidaan hyödyntää kliinisissä toimenpiteissä. Osalla KML-potilaista Philadelphia-translokaation syntymähetkellä kromosomi 9:stä häviää alue, joka sisältämillä geeneillä on todennäköisesti tärkeä merkitys taudin patogeneesissä. (der 9 deleetio). Deleetion omaavien potilaiden tauti etenee nopeasti ja vastaa huonosti perinteiseen lääkehoitoon. Der 9 deleetion vaikutusta KML-potilaiden taudinkulkuun ja hoitovasteeseen allogeenisen kantasolujensiirron jälkeen tutkittiin yli sadan KML-potilaan aineistossa, jossa 15%:lla tutkituista todettiin kyseinen deleetio. Kantasolujensiirron jälkeen taudin uusiutumisessa ei todettu eroa potilaiden, joilla oli todettu deleetio, tai potilaiden, joilla deleetiota ei todettu, välillä. Myöskään kokonaiselossaoloajassa, kantasolujensiirtoon liittyvässä kuolleisuudessa tai leukemia-vapaassa elinajassa ei todettu eroja näiden ryhmien välillä. Perinteisiä hoitomuotoja käytettäessä der 9 deleetiota voitaisiin muiden ennustetekijöiden ohella pitää yhtenä tekijänä kantasolujensiirtoa harkittaessa. Tyrosiinikinaasin estäjälääkitystä käytettäessä deleetion merkitys ei kuitenkaan toistaiseksi ole selvillä, mikä antaa aihetta lisätutkimuksille. Imatinibilääkityksellä hoidettavien potilaiden luuydinnäytteissä todetaan toisinaan lymfosyyttiylimäärää, jonka ennusteellista merkitystä potilaan hoitovasteeseen arvioitiin neljännessä osatyössä. Luuytimen lymfosytoosin todettiin olevan uusi, vahva ennustetekijä yhdessä sytogeneettisen vasteen kanssa imatinibihoidon optimaalisen molekyylitason vasteen suhteen. Heikon 12 kuukauden hoitovasteen saaneet potilaat voitiin todeta jo kolmen kuukauden seurantanäytteen yhteydessä lymfosytoosin puuttuessa. Luuytimen lymfosyyttien määritystä voitaisiinkin pitää yhtenä imatinibihoidon alkuvaiheen vastemittarina. Osa imatinibilla hoidetuista potilaista menettää hoitovasteen ajan kuluessa, eli potilaille kehittyy imatinibiresistenssi. Tämä johtuu useimmiten BCR-ABL-geenin mutaatioista, joista osaa voidaan estää suuremmalla imatinibiannoksella, osa taas vaatii kokonaan uuden lääkkeen. Mutaatioiden tunnistaminen onkin merkittävää potilaan hoidon kannalta. Väitöskirjan viides osatyö kartoitti imatinibiresistenssiin liittyviä mutaatioita sekä suomalaisessa että norjalaisessa potilasaineistossa. Tutkimuksessa todetut pistemutaatiot olivat tunnettuja imatinibiresistenssin aiheuttavia muutoksia. Näiden lisäksi aineistossa todettiin muita DNA-muutoksia, kuten häviämiä tai eksonien silmukoitumista. Näiden löydösten kliininen merkitys on kuitenkin avoin ja vaatii jatkotutkimuksia. Työ on tuottanut uuden tutkimustiedon lisäksi diagnostisessa käytössä olevan menetelmän, joka voidaan tehdä potilasnäytteistä lääkeresistenssiä epäiltäessä.