Latent TGF-beta Binding Proteins : Adhesive functions and matrix association of LTBP-2 and potential functions of LTBP-1 and LTBP-3 in mesothelioma

Latent transforming growth factor-beta (TGF-beta) binding proteins (LTBPs) -1, -3 and -4 are ECM components whose major function is to augment the secretion and matrix targeting of TGF-beta, a multipotent cytokine. LTBP-2 does not bind small latent TGF-beta but has suggested functions as a structural protein in ECM microfibrils. In the current work we focused on analyzing possible adhesive functions of LTBP-2 as well as on characterizing the kinetics and regulation of LTBP-2 secretion and ECM deposition. We also explored the role of TGF-beta binding LTBPs in endothelial cells activated to mimic angiogenesis as well as in malignant mesothelioma. We found that, unlike most adherent cells, several melanoma cell lines efficiently adhered to purified recombinant LTBP-2. Further characterization revealed that the adhesion was mediated by alpha3beta1 and alpha6beta1 integrins. Heparin also inhibited the melanoma cell adhesion suggesting a role for heparan sulphate proteoglycans. LTBP-2 was also identified as a haptotactic substrate for melanoma cell migration. We used cultured human embryonic lung fibroblasts to analyze the temporal and spatial association of LTBP-2 into ECM. By We found that LTBP-2 was efficiently assembled to the ECM only in confluent cultures following the deposition of fibronectin (FN) and fibrillin-1. In early, subconfluent cultures it remained primarily in soluble form after secretion. LTBP-2 colocalized transiently with FN and fibrillin-1. Silencing of fibrillin-1 expression by lentiviral shRNAs profoundly disrupted the deposition of LTBP-2 indicating that the ECM association of LTBP-2 depends on a pre-formed fibrillin-1 network. Considering the established role of TGF-beta as a regulator of angiogenesis we induced morphological activation of endothelial cells by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and followed the fate of LTBP-1 in the endothelial ECM. This resulted in profound proteolytic processing of LTBP-1 and release of latent TGF-beta complexes from the ECM. The processing was coupled with increased activation of MT-MMPs and specific upregulation of MT1-MMP. The major role of MT1-MMP in the proteolysis of LTBP-1 was confirmed by suppressing the expression with lentivirally induced short-hairpin RNAs as well as by various metalloproteinases inhibitors. TGF-beta can promote tumorigenesis of malignant mesothelioma (MM), which is an aggressive tumor of the pleura with poor prognosis. TGF-beta activity was analyzed in a panel of MM tumors by immunohistochemical staining of phosphorylated Smad-2 (P-Smad2). The tumor cells were strongly positive for P-Smad2 whereas LTBP-1 immunoreactivity was abundant in the stroma, and there was a negative correlation between LTBP-1 and P-Smad2 staining. In addition, the high P-Smad2 immunoreactivity correlated with shorter survival of patients. mRNA analysis revealed that TGF-beta1 was the most highly expressed isoform in both normal human pleura and MM tissue. LTBP-1 and LTBP-3 were both abundantly expressed. LTBP-1 was the predominant isoform in established MM cell lines whereas the expression of LTBP-3 was high in control cells. Suppression of LTBP-3 expression by siRNAs resulted in increased TGF-beta activity in MM cell lines accompanied by decreased proliferation. Our results suggest that decreased expression of LTBP-3 in MM could alter the targeting of TGF-beta to the ECM and lead to its increased activation. The current work emphasizes the coordinated process of the assembly and appropriate targeting of LTBPs with distinct adhesive or cytokine harboring properties into the ECM. The hierarchical assembly may have implications in the modulation of signaling events during morphogenesis and tissue remodeling.

Soluväliaine on merkittävä kudosten ja elinten kehityksen ja toiminnan säätelijä. Se tukee soluja mutta myös säätelee liukoisten molekyylien, kuten kasvutekijöiden, aktiivisuutta. Transformoiva kasvutekijä beta (TGF-beta) vaikuttaa mm. solujen erilaistumiseen ja kasvuun sekä säätelee yksilönkehitystä ja immuunijärjestelmää. Se lisää soluväliaineen muodostusta ja estää mm. invasiivisille kasvaimille tyypillistä soluväliaineen hajotusta. TGF-beta eritetään yleensä inaktiivisessa (latentti) muodossa ja varastoidaan soluväliaineeseen LTBP-proteiinin (latent TGF-beta binding protein) välityksellä. LTBP-proteiinit ovat soluväliaineen proteiineja ja kuuluvat fibrilliini/LTBP-perheeseen jonka jäseniä ovat fibrilliinit 1-3 sekä LTBP:t 1-4. LTBP proteiineja tarvitaan TGF-betan tehokkaaseen eritykseen solusta sekä sen ohjaamiseen soluväliaineeseen. LTBP-2 on muista LTBP proteiineista poikkeava sillä se ei sido latenttia TGF-betaa. LTBP-2 poistogeeninen hiirialkio kuolee pian hedelmöittymisen jälkeen mikä kertoo ko. proteiinin olevan välttämätön yksilönkehitykselle. Alkion kuolema jo ennen kohtuun kiinnittymistä voi viitata ongelmiin mm. solujen kiinnittymisessä Väitöstutkimuksen tavoitteena oli selvittää LTBP-2:n merkitystä solujen kiinnittymisessä ja liikkumisessa sekä analysoida LTBP-2 erityksen ja soluväliaineeseen rakentumisen kinetiikkaa ja säätelyä. Työssä tutkittiin myös TGF-betan vapautumisen mekanismeja endoteelisolujen soluväliaineesta sekä LTBP-proteiinien osuutta TGF-beta-aktiivisuuden säätelyssä keuhkon mesotelioomassa. Tutkimuksissamme havaittiin että toisin kuin solut yleensä, kaikki tutkitut melanoomasolut pystyvät tarttumaan puhdistettuun rekombinantti-LTBP-2:een. Tarttuminen on solun pintareseptoreista, beta1-integriineistä, riippuvaista. Havaitsimme myös melanoomasolujen pystyvän liikkumaan LTBP-2-proteiinilla päällystetyillä kalvoilla. LTBP-2 eritystä ja soluväliaineeseen ohjautumista tutkittiin eri ikäisillä ihmisen keuhkon fibroblastiviljelmillä. LTBP-2 erittyy soluista nopeasti mutta solun ulkoisesta matriksista se havaittiin vasta 4-5 vuorokauden jälkeen. LTBP-2 siis tarvitsee yhtä tai useampaa varhain eritettävää proteiinia joihin säikeet voivat rakentua. LTBP-2 havaittin samoista säikeisistä rakenteista fibrilliini-1:n kanssa, ja vaimentamalla fibrilliini-1 ilmentymisen havaitsimme että LTBP-2:n matriksiin rakentuminen on fibrilliini-1:stä riippuvaista. Tutkiessamme TGF-betan vapautumisen mekanismeja endoteelisoluissa havaitsimme että solukalvoon kiinnittynyt proteaasi MT1-MMP pilkkoo LTBP-1-proteiinia vapauttaen latenttia TGF-betaa. Muiden LTBP-proteiinien pilkkoutumista ei havaittu joten ilmiö on spesifi LTBP-1:lle ja mahdollisesti myös endoteelisoluille, sillä vapautumista ei tapahtunut fibroblasteissa. Mesotelioomatutkimuksessa käytimme sekä kudosnäytteitä potilaista että kasvaimista eristettyjä solulinjoja. Kudostasolla TGF-betan aktiivisuudesta kertova P-Smad2 näkyi merkittävästi runsaampana kasvainkudoksessa kuin ympäröivässä stroomassa. Stroomassa puolestaan LTBP-1:n immunoreaktiivisuus oli suurempi. Lisäksi korkeat P-Smad2-tasot olivat yhteydessä huonoon ennusteeseen. Soluviljelmillä tehdyissä kokeissa havaitsimme että sekä aktiivisen että latentin TGF-betan määrä on korkeampi mesotelioomasoluissa kuin kontrollisoluissa. siRNA-kokeiden avulla saimme selville että LTBP-3:n ekspression hiljentäminen lisää TGF-beta-aktiivisuutta syöpäsoluissa ja vähentää niiden kasvua. Väitöstutkimus antaa uutta tietoa yksilönkehitykselle tärkeän mutta toiminnoiltaan huonosti tunnetun LTBP-2-proteiinin biologisista vaikutuksista ja soluväliaineeseen rakentumisesta. Tulokset myös korostavat soluväliaineen LTBP-proteiinien merkitystä kasvutekijä TGF-betan toiminnan säätelyssä ja syövän kehityksessä.