Genomic microarrays in chromosomal analysis of leukemia

Chromosomal alterations in leukemia have been shown to have prognostic and predictive significance and are also important minimal residual disease (MRD) markers in the follow-up of leukemia patients. Although specific oncogenes and tumor suppressors have been discovered in some of the chromosomal alterations, the role and target genes of many alterations in leukemia remain unknown. In addition, a number of leukemia patients have a normal karyotype by standard cytogenetics, but have variability in clinical course and are often molecularly heterogeneous. Cytogenetic methods traditionally used in leukemia analysis and diagnostics; G-banding, various fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques, and chromosomal comparative genomic hybridization (cCGH), have enormously increased knowledge about the leukemia genome, but have limitations in resolution or in genomic coverage. In the last decade, the development of microarray comparative genomic hybridization (array-CGH, aCGH) for DNA copy number analysis and the SNP microarray (SNP-array) method for simultaneous copy number and loss of heterozygosity (LOH) analysis has enabled investigation of chromosomal and gene alterations genome-wide with high resolution and high throughput. In these studies, genetic alterations were analyzed in acute myeloid leukemia (AML) and chronic lymphocytic leukemia (CLL). The aim was to screen and characterize genomic alterations that could play role in leukemia pathogenesis by using aCGH and SNP-arrays. One of the most important goals was to screen cryptic alterations in karyotypically normal leukemia patients. In addition, chromosomal changes were evaluated to narrow the target regions, to find new markers, and to obtain tumor suppressor and oncogene candidates. The work presented here shows the capability of aCGH to detect submicroscopic copy number alterations in leukemia, with information about breakpoints and genes involved in the alterations, and that genome-wide microarray analyses with aCGH and SNP-array are advantageous methods in the research and diagnosis of leukemia. The most important findings were the cryptic changes detected with aCGH in karyotypically normal AML and CLL, characterization of amplified genes in 11q marker chromosomes, detection of deletion-based mechanisms of MLL-ARHGEF12 fusion gene formation, and detection of LOH without copy number alteration in karyotypically normal AML. These alterations harbor candidate oncogenes and tumor suppressors for further studies.

Kromosomimuutokset ovat tärkeitä ennusteeseen vaikuttavia tekijöitä leukemioiden diagnostiikassa ja niitä voidaan myös hyödyntää jäännöstaudin havaitsemiseksi hoidon jälkeisessä seurannassa. Useiden tunnettujen kromosomimuutosten kohdegeenejä ja mahdollisia muutosten taustalla vaikuttavia molekyylimekanismeja ei kuitenkaan tunneta. Lisäksi normaali karyotyyppi on yleinen löydös mm. akuutissa myelooisessa leukemiassa (AML) ja kroonisessa lymfaattisessa leukemiassa (KLL). Submikroskooppiset muutokset voisivat osittain selittää normaalikaryotyyppisten potilaiden ryhmän sisäistä heterogeenisuutta. Kromosomeja on analysoitu periteisesti G-raita karyotyypityksellä, erilaisilla fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) menetelmillä ja kromosomien vertailevalla genomisella hybridisaatiolla (kromosomi-VGH). Vaikka nämä menetelmät ovat tuottaneet paljon tietoa kromosomimuutoksista, on niiden rajoitteena ollut alhainen erotuskyky tai ne ovat kerralla tuottaneet tietoa vain pienestä genomin alueesta. DNA-mikrosiruanalyysit ovat mahdollistaneet koko genomin laajuisen ja erotuskykyisen geenien kopiomäärien analyysin. Mikrosiru-VGH (array-CGH) menetelmällä voidaan analysoida geenien kopiolukuja ja SNP-siruilla (single nucleotide polymorphism array) voidaan geenien kopiolukujen lisäksi analysoida myös alleelista epätasapainoa (LOH). Tässä työssä tutkittiin AML ja KLL näytteitä käyttäen näitä mikrosiruanalyysejä. Tarkoituksena oli löytää uusia markkereita sekä kasvunrajoitegeeni ja onkogeeni kandidaatteja. Erityisesti haluttiin etsiä submikroskooppisia muutoksia normaalikaryotyypin leukemioissa. Osatyössä I tutkittiin kromosomin 11 q varren muutoksia AML:ssä, osatöissä II ja IV analysoitiin normaalikaryotyypin AML näytteitä ja osatyössä III tutkittiin kromosomimuutoksia KLL potilailla. Näissä tutkimuksissa havaittiin uusia kromosomi ja geenimuutoksia sekä karakterisoitiin jo tunnettujen muutosten katkoskohtia ja geenejä. Osatöissä havaittiin submikroskooppisia kopiolukumuutoksia normaalikaryotyypin AML:ssa ja KLL:ssa sekä LOH alueita normaalikaryotyypin AML:ssa. Lisäksi AML:ssa tunnistettiin kromosomin 11 materiaalista koostuvien markkeri-kromosomien monistuneet geenit sekä löydettiin MLL-ARHGEF12 fuusiogeenin muodostumiseen liittyvä submikroskooppinen deleetio. Tulosten perusteella mikrosiru-VGH ja SNP-siru menetelmät ovat hyödyllisiä leukemian diagnostiikassa ja tutkimuksessa, sillä ne voivat paljastaa tavanomaisilla menetelmillä huomaamattomia kromosomi- ja geenimuutoksia.