Latent TGF-β binding proteins -3 and -4 : transcriptional control and extracellular matrix targeting

Extracellular matrix (ECM) is a complex network of various proteins and proteoglycans which provides tissues with structural strength and resilience. By harvesting signaling molecules like growth factors ECM has the capacity to control cellular functions including proliferation, differentiation and cell survival. Latent transforming growth factor β (TGF-β) binding proteins (LTBPs) associate fibrillar structures of the ECM and mediate the efficient secretion and ECM deposition of latent TGF-β. The current work was conducted to determine the regulatory regions of LTBP-3 and -4 genes to gain insight into their tissue-specific expression which also has impact on TGF-β biology. Furthermore, the current research aimed at defining the ECM targeting of the N-terminal variants of LTBP-4 (LTBP-4S and -4L), which is required to understand their functions in tissues and to gain insight into conditions in which TGF-β is activated. To characterize the regulatory regions of LTBP-3 and -4 genes in silico and functional promoter analysis techniques were employed. It was found that the expression of LTBP-4S and -4L are under control of two independent promoters. This finding was in accordance with the observed expression patterns of LTBP-4S and -4L in human tissues. All promoter regions characterized in this study were TATAless, GC-rich and highly conserved between human and mouse species. Putative binding sites for Sp1 and GATA family of transcription factors were recognized in all of these regulatory regions. It is possible that these transcription factors control the basal expression of LTBP-3 and -4 genes. Smad binding element was found within the LTBP-3 and -4S promoter regions, but it was not present in LTBP-4L promoter. Although this element important for TGF-β signaling was present in LTBP-4S promoter, TGF-β did not induce its transcriptional activity. LTBP-3 promoter activity and mRNA expression instead were stimulated by TGF-β1 in osteosarcoma cells. It was found that the stimulatory effect of TGF-β was mediated by Smad and Erk MAPK signaling pathways. The current work explored the ECM targeting of LTBP-4S and identified binding partners of this protein. It was found that the N-terminal end of LTBP-4S possesses fibronectin (FN) binding sites which are critical for its ECM targeting. FN deficient fibroblasts incorporated LTBP-4S into their ECM only after addition of exogenous FN. Furthermore, LTBP-4S was found to have heparin binding regions, of which the C-terminal binding site mediated fibroblast adhesion. Soluble heparin prevented the ECM association of LTBP-4S in fibroblast cultures. In the current work it was observed that there are significant differences in the secretion, processing and ECM targeting of LTBP-4S and -4L. Interestingly, it was observed that most of the secreted LTBP-4L was associated with latent TGF-β1, whereas LTBP-4S was mainly secreted as a free form from CHO cells. This thesis provides information on transcriptional regulation of LTBP-3 and -4 genes, which is required for the deeper understanding of their tissue-specific functions. Further, the current work elucidates the structural variability of LTBPs, which appears to have impact on secretion and ECM targeting of TGF-β. These findings may advance understanding the abnormal activation of TGF-β which is associated with connective tissue disorders and cancer.

Soluväliaine on proteiineista muodostuvien säikeiden ja niitä ympäröivien proteoglykaanien sekä glykoproteiinien muodostama kokonaisuus, joka paitsi tukee kudosten soluja myös osallistuu niiden toimintojen säätelyyn kontrolloimalla signaalimolekyylien aktiivisuutta. Soluväliaineen tyypillisimpiä proteiineja ovat kollageenit, elastiini sekä fibrilliinit, jotka muodostavat säiemäisiä rakenteita. Näiden lisäksi soluväliaineessa on lukuisia muita proteiineja, jotka ovat oleellisia kudosten ja elinten normaalille toiminnalle. Soluväliaineen proteiinien ilmentymisessä tapahtuvat muutokset tai niiden rakenteellinen poikkeavuus saattavat siten vaikuttaa erilaisten sidekudossairauksien tai syövän syntyyn. LTBP-proteiinit (latent TGF-β binding protein), jotka olivat tämän tutkimuksen kohteena, ovat LTBP/fibrilliini-perheeseen kuuluvia soluväliaineen proteiineja. LTBP-1, -3 ja -4 erittyvät soluista sekä vapaina että liittyneenä TGF-β-kasvutekijän kanssa. TGF-β, joka puolestaan on tärkeä solujen kasvun ja erilaistumisen säätelijä, myös varastoituu soluväliaineen rakenteisiin LTBP-proteiinien välityksellä. LTBP-proteiineilla on osoitettu olevan tärkeä merkitys TGF-β kasvutekijän aktivoitumisessa, joten LTBP-proteiinien ilmentymiseen vaikuttavien tekijöiden sekä niiden rakenteellisten ominaisuuksien tunteminen on tärkeää TGF-β:n säätelyn kannalta. LTBP-proteiineilla on kudoksissa myös muita, TGF-β:sta riippumattomia tehtäviä, kuten avustaminen elastisten säikeiden muodostumisessa. Tämän väitöstutkimuksen tavoitteena oli tutkia LTBP-3 ja -4 geenien ilmentymiseen vaikuttavia tekijöitä sekä määrittää kyseisten geenien säätelystä vastaavat promoottorialueet. Tutkimuksessa löydettiin useita potentiaalisia transkriptiotekijöiden sitoutumiskohtia. TGF-β:n havaittiin lisäävän LTBP-3 geenin promoottoriaktiivisuutta osteosarkoomasoluissa. TGF-β:n vaikutusten välittäjiksi osoittautuivat Smad-ja Erk MAPK- signaalireitit, joiden kohdemolekyylit sitoutuvat Smad3/4 ja AP-1 elementteihin LTBP-3 geenin säätelyalueella. Tutkimuksessa osoitettiin myös, että LTBP-4-proteiinin N-terminaaliset varianttimuodot (LTBP-4S ja -4L) ovat kahden itsenäisen geeenisäätelyalueen alaisia. LTBP-3, -4S ja -4L promoottoreille yhteistä olivat GATA- ja Sp1-transkriptiotekijöiden sitoutumiskohdat, jotka mahdollisesti vastaavat kyseisten geenien perustranskriptiosta.Kaikki säätelyalueet olivat myös hyvin GC-rikkaita. Väitöstutkimuksessa selvitettiin myös LTBP-4S- ja -4L-proteiinien liittymistä soluväliaineen rakenteisiin. LTBP-4S:n N-terminaalisen alueen havaittiin sitoutuvan soluväliaineen fibronektiini-proteiiniin. Kyseisen vuorovaikutuksen osoitettiin olevan välttämätön LTBP-4S:n varhaiselle liittymiselle soluväliaineen rakenteisiin, kun taas kehittyneemmässä soluväliaineessa muut vuorovaikutukset näyttäisivät määrävän LTBP-4S:n sijainnin. Lisäksi tutkimuksessa löydettiin hepariinia sitovia alueita LTBP-4S-molekyylistä, jotka ainakin osittain toimivat soluadheesiossa tarttumispintana. Väitöstutkimuksen mukaan LTBP-4S- ja -4L-proteiinien erittymisessä soluista sekä niiden prosessoinnissa on merkittäviä eroja. Tärkeä havainto oli TGF-β1:n sitoutuminen LTBP-4L:n kanssa. LTBP-4S sen sijaan erittyi soluista pääasiassa vapaana muotona. Väitöstutkimuksessa tehdyt havainnot auttavat ymmärtämään LTBP-3 ja -4-proteiinien ilmentymistä kudoksissa. Lisäksi havaitut LTBP-proteiinien vuorovaikutukset muiden soluväliainemolekyylien kanssa selkeyttävät TGF-β-kasvutekijän sijoittumista soluväliaineen rakenteisiin ja ovat siten tärkeitä TGF-β-aktivaation ymmärtämiselle.