Modern diagnosis of Epstein-Barr virus infections and post-transplant lymphoproliferative disease

Infection by Epstein-Barr virus (EBV) occurs in approximately 95% of the world s population. EBV was the first human virus implicated in oncogenesis. Characteristic for EBV primary infection are detectable IgM and IgG antibodies against viral capsid antigen (VCA). During convalescence the VCA IgM disappears while the VCA IgG persists for life. Reactivations of EBV occur both among immunocompromised and immunocompetent individuals. In serological diagnosis, measurement of avidity of VCA IgG separates primary from secondary infections. However, in serodiagnosis of mononucleosis it is quite common to encounter, paradoxically, VCA IgM together with high-avidity VCA IgG, indicating past immunity. We determined the etiology of this phenomenon and found that, among patients with cytomegalovirus (CMV) primary infection a large proportion (23%) showed antibody profiles of EBV reactivation. In contrast, EBV primary infection did not appear to induce immunoreactivation of CMV. EBV-associated post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD) is a life threatening complication of allogeneic stem cell or solid organ transplantation. PTLD may present with a diverse spectrum of clinical symptoms and signs. Due to rapidity of PTLD progression especially after stem cell transplantation, the diagnosis must be obtained quickly. Pending timely detection, the evolution of the fatal disease may be halted by reduction of immunosuppression. A promising new PTLD treatment (also in Finland) is based on anti-CD-20 monoclonal antibodies. Diagnosis of PTLD has been demanding because of immunosuppression, blood transfusions and the latent nature of the virus. We set up in 1999 to our knowledge first in Finland for any microbial pathogen a real-time quantitative PCR (qPCR) for detection of EBV DNA in blood serum/plasma. In addition, we set up an in situ hybridisation assay for EBV RNA in tissue sections. In collaboration with a group of haematologists at Helsinki University Central Hospital we retrospectively determined the incidence of PTLD among 257 allogenic stem cell transplantations (SCT) performed during 1994-1999. Post-mortem analysis revealed 18 cases of PTLD. From a subset of PTLD cases (12/18) and a series of corresponding controls (36), consecutive samples of serum were studied by the new EBV-qPCR. All the PTLD patients were positive for EBV-DNA with progressively rising copy numbers. In most PTLD patients EBV DNA became detectable within 70 days of SCT. Of note, the appearance of EBV DNA preceded the PTLD symptoms (fever, lymphadenopathy, atypical lymphocytes). Among the SCT controls, EBV DNA occurred only sporadically, and the EBV-DNA levels remained relatively low. We concluded that EBV qPCR is a highly sensitive (100%) and specific (96%) new diagnostic approach. We also looked for and found risk factors for the development of PTLD. Together with a liver transplantation group at the Transplantation and Liver Surgery Clinic we wanted to clarify how often and how severely do EBV infections occur after liver transplantation. We studied by the EBV qPCR 1284 plasma samples obtained from 105 adult liver transplant recipients. EBV DNA was detected in 14 patients (13%) during the first 12 months. The peak viral loads of 13 asymptomatic patients were relatively low (<6600/ml), and EBV DNA subsided quickly from circulation. Fatal PTLD was diagnosed in one patient. Finally, we wanted to determine the number and clinical significance of EBV infections of various types occurring among a large, retrospective, nonselected cohort of allogenic SCT recipients. We analysed by EBV qPCR 5479 serum samples of 406 SCT recipients obtained during 1988-1999. EBV DNA was seen in 57 (14%) patients, of whom 22 (5%) showed progressively rising and ultimately high levels of EBV DNA (median 54 million /ml). Among the SCT survivors, EBV DNA was transiently detectable in 19 (5%) asymptomatic patients. Thereby, low-level EBV-DNA positivity in serum occurs relatively often after SCT and may subside without specific treatment. However, high molecular copy numbers (>50 000) are diagnostic for life-threatening EBV infection. We furthermore developed a mathematical algorithm for the prediction of development of life-threatening EBV infection.

Epstein-Barrin virus (EBV) aiheuttaa nuoruusiässä yleisen mononukleoosin, mutta liittyy myös pahanlaatuisiin tauteihin. Perusterveillä infektiopotilailla EBV-infektio voidaan osoittaa luotettavasti modernien virusvasta-ainetutkimusten eli serologian avulla. Primaarissa EBV-infektiossa kehittyy IgM- ja IgG-vasta-aineita viruksen kapsidiantigeenille (viral capsid antigen, VCA). Toipumisvaiheessa VCA-IgM- vasta-aineet häviävät, kun taas VCA-IgG-vasta-aineet säilyvät koko eliniän. EBV voi aktivoitua elimistössä, ja tuolloin serologia yksinään ei riitä taudinmääritykseen. Määrittämällä VCA-IgG:n aviditeetti eli sitoutumisvoima voidaan erottaa toisistaan tuore infektio ja elimistössä piilevän viruksen aktivoituminen. Mononukleoosin diagnostiikassa nähdään toisinaan, paradoksaalisesti, VCA-IgM samanaikaisesti korkea-aviidisen VCA-IgG:n kanssa. Selvitimme tämän ilmiön syytä ja totesimme, että primaari sytomegalovirus (CMV) -infektio aiheuttaa joka neljännellä potilaalla EBV:n aktivoitumisen tai VCA-IgM:n ilmaantumisen. Primaarinen EBV-infektio sen sijaan ei aktivoinut CMV:ta vastaavalla tavalla. Elimistön immuunipuolustuksen heikentyessä, kuten elinsiirtojen yhteydessä tai AIDS-potilailla, EBV:n aktivoituminen voi saada elimistön valkosolut lisääntymään hallitsemattomasti. Tätä EBV:n aiheuttamaa lymfoproliferatiivista syndroomaa (post-transplant lymphoproliferative disease, PTLD) esiintyy erityisesti luuytimen, mutta myös kiinteiden elinten (maksa, munuainen, sydän), siirtojen yhteydessä. PTLD:n taudinkuva vaihtelee diffuusista muodosta B-solulymfoomaan ja vaikeusaste lievästä henkeä uhkaavaan; fataalit muodot ovat hyvinkin nopeasti progredioivia. Pääasiallisena hoitona on käytetty immunosuppression keventämistä, mikä edellyttää taudin varhaistoteamista. Lupaavan tehokas uusi hoitomuoto perustuu solutyyppispesifisten CD-vasta-aineiden käyttöön (myös Suomessa). PTLD:n diagnostiikka on ollut ongelmallista immunosuppression, siirtoverituotteiden ja viruksen piilevyyden vuoksi. Olemme vuonna 1999, ensimmäisenä Suomessa minkään mikrobin osalta, pystyttäneet EBV-tautien, ml. PTLD, diagnostiikkaan kvantitatiivisen real-time tyyppisen geenimonistusmenetelmän. Lisäksi pystytimme in situ hybridisaatio -menetelmän, jonka avulla EBV:n RNA voidaan osoittaa kudoksista. Yhteistyössä Meilahden sairaalan hematologien kanssa määritimme takautuvasti fataalin PTLD:n esiintyvyyden luuydin-kantasolusiirroissa (LYS) vuosina 1994-1999. Post-morten -analyysi paljasti 18 PTLD-tapausta. Tutkimme suuren aineiston pakastettuja seeruminäytteitä osasta PTLD-tapauksia (N=12) ja vastaavista verrokkipotilaista (N=36) uuden, kvantitatiivisen EBV-qPCR:n avulla: Kaikilla PTLD-potilailla havaittiin seeruminäytteissä EBV-DNA:ta, jonka määrä lisääntyi nopeasti taudin vaikeutuessa. EBV-DNA ilmaantui verenkiertoon keskimäärin 70 päivää luuydinsiirron jälkeen. EBV DNA oli havaittavissa uudella menetelmällä jo ennen oireiden puhkeamista (kuume, imusolmukkeiden suurentuminen) tai verenkuvan muutoksia. Verrokkiryhmässä EBV-DNA:ta näkyi vain satunnaisesti ja sen määrä jäi matalaksi. EBV-qPCR:n herkkyys ja tarkkuus olivat erinomaiset. Etsimme ja löysimme luuydinsiirtopotilasaineistosta myös PTLD-taudille altistavia riskitekijöitä. Selvitimme yhteistyössä elinsiirtokirurgiryhmän kanssa niin ikään EBV-infektioiden yleisyyttä ja vakavuutta maksansiirtopotilailla; tutkimme EBV-qPCR-menetelmän avulla 1284 plasmanäytettä 105:ltä aikuiselta maksansiirtopotilaalta. EBV-DNA:ta löydettiin 14 siirrepotilaalta (13%) ensimmäisten 12 kuukauden aikana. Kolmellatoista oireettomalla maksasiirtopotilaalla EBV-DNA:n määrät jäivät mataliksi (<6600/ml), ja EBV-DNA hävisi verenkierrosta nopeasti. Yhdelle potilaalle kehittyi fataali PTLD. Halusimme vielä selvittää erityyppisten EBV-infektioiden kokonaismäärän suurella, retrospektiivisellä aineistolla luuydinsiirtopotilaita: analysoimme EBV-qPCR:n avulla 5479 seeruminäytettä 406 potilaalta. EBV-DNA:ta löytyi kaikkiaan 57 potilaalta (14.0 %), joista 22:lla EBV-DNA määrä nousi korkealle (keskiarvo 54 milj./ml). Oireeton EBV-infektio todettiin 19 potilaalla (4.7 %), joilla nähtiin EBV-DNA:ta ohimenevästi (keskiarvo 6300/ml). Näin ollen matala EBV-positiivisuus näyttää olevan varsin yleistä luuydinsiirron jälkeen, ja EBV-DNA voi hävitä ilman toimenpiteitä. Kuitenkin EBV-DNA:n suuri pitoisuus (>50 000/ml) viittaa vahvasti hengenvaaralliseen EBV-infektioon. Kehitimme lopuksi EBV-DNA-tasojen matemaattisen analyysikaavan, jonka avulla voidaan ennustaa henkeä uhkaavan EBV-infektion kehittymistä.