Pharmacogenetic Variation at CYP2D6, CYP2C9, and CYP2C19: Population Genetic and Forensic Aspects

Pharmacogenetics deals with genetically determined variation in drug response. In this context, three phase I drug-metabolizing enzymes, CYP2D6, CYP2C9, and CYP2C19, have a central role, affecting the metabolism of about 20-30% of clinically used drugs. Since genes coding for these enzymes in human populations exhibit high genetic polymorphism, they are of major pharmacogenetic importance. The aims of this study were to develop new genotyping methods for CYP2D6, CYP2C9, and CYP2C19 that would cover the most important genetic variants altering the enzyme activity, and, for the first time, to describe the distribution of genetic variation at these loci on global and microgeographic scales. In addition, pharmacogenetics was applied to a postmortem forensic setting to elucidate the role of genetic variation in drug intoxications, focusing mainly on cases related to tricyclic antidepressants, which are commonly involved in fatal drug poisonings in Finland. Genetic variability data were obtained by genotyping new population samples by the methods developed based on PCR and multiplex single-nucleotide primer extension reaction, as well as by collecting data from the literature. Data consisted of 138, 129, and 146 population samples for CYP2D6, CYP2C9, and CYP2C19, respectively. In addition, over 200 postmortem forensic cases were examined with respect to drug and metabolite concentrations and genotypic variation at CYP2D6 and CYP2C19. The distribution of genetic variation within and among human populations was analyzed by descriptive statistics and variance analysis and by correlating the genetic and geographic distances using Mantel tests and spatial autocorrelation. The correlation between phenotypic and genotypic variation in drug metabolism observed in postmortem cases was also analyzed statistically. The genotyping methods developed proved to be informative, technically feasible, and cost-effective. Detailed molecular analysis of CYP2D6 genetic variation in a global survey of human populations revealed that the pattern of variation was similar to those of neutral genomic markers. Most of the CYP2D6 diversity was observed within populations, and the spatial pattern of variation was best described as clinal. On the other hand, genetic variants of CYP2D6, CYP2C9, and CYP2C19 associated with altered enzymatic activity could reach extremely high frequencies in certain geographic regions. Pharmacogenetic variation may also be significantly affected by population-specific demographic histories, as seen within the Finnish population. When pharmacogenetics was applied to a postmortem forensic setting, a correlation between amitriptyline metabolic ratios and genetic variation at CYP2D6 and CYP2C19 was observed in the sample material, even in the presence of confounding factors typical for these cases. In addition, a case of doxepin-related fatal poisoning was shown to be associated with a genetic defect at CYP2D6. Each of the genes studied showed a distinct variation pattern in human populations and high frequencies of altered activity variants, which may reflect the neutral evolution and/or selective pressures caused by dietary or environmental exposure. The results are relevant also from the clinical point of view since the genetic variation at CYP2D6, CYP2C9, and CYP2C19 already has a range of clinical applications, e.g. in cancer treatment and oral anticoagulation therapy. This study revealed that pharmacogenetics may also contribute valuable information to the medicolegal investigation of sudden, unexpected deaths.

Farmakogenetiikka tutkii yksilöiden lääkeainevasteeseen vaikuttavia perinnöllisiä tekijöitä. Lääkeaineita metaboloivat entsyymit CYP2D6, CYP2C9 ja CYP2C19 ovat keskeisiä farmakogeneettisessä tutkimuksessa, sillä niiden kautta metaboloituu noin 20-30% kliinisesti käytetyistä lääkeaineista ja ne ovat geneettisesti polymorfisia. Entsyymien aktiivisuus vaihtelee hitaasta ultranopeaan, minkä seurauksena yksilöt voivat altistua esimerkiksi lääkeaineiden yllättäville sivu- ja yhteisvaikutuksille. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää CYP2D6-, CYP2C9- ja CYP2C19-geeneille genotyypitysmenetelmä, joka kattaa tärkeimmät entsyymien aktiivisuuteen vaikuttavat mutaatiot, ja kuvata näiden geenien variaatio erilaisissa ihmisväestöissä ensimmäistä kertaa maailmanlaajuisessa mittakaavassa. Lisäksi farmakogenetiikkaa sovellettiin oikeuslääketieteeseen tutkimalla geneettisen variaation merkitystä kuolemaan johtaneissa lääkeainemyrkytyksissä. Kehitetyt genotyypitysmenetelmät perustuivat polymeraasiketjureaktioon ja minisekvensointiin ja ne osoittautuivat luotettaviksi ja edullisiksi. Tutkimuksen aineisto, joka koostui 138 (CYP2D6), 129 (CYP2C9) ja 146 (CYP2C19) populaationäytteestä, kerättiin sekä genotyypittämällä uusia näytteitä että keräämällä aineistoa kirjallisuudesta. CYP2D6-geenin variaation molekulaarinen analysointi osoitti, että sen maailmanlaajuinen vaihtelu ihmisväestöissä on verrattavissa neutraalien genomisten markkereiden variaatioon: suurin osa diversiteetistä oli yksilöiden välillä ja vaihtelu eri maantieteellisillä alueilla oli asteittaista. Toisaalta kaikkien tutkittujen geenien muuttuneen entsyymiaktiivisuuden variantit olivat yleisiä ja esiintyivät tietyillä maantieteellisillä alueilla hyvin korkeilla frekvensseillä. Variaation analysointi suomalaisessa väestössä myös osoitti, että väestödemografiset tekijät voivat vaikuttaa merkittävästi farmakogeneettiseen variaatioon. Tutkimuksen tulokset korostavat yksilöllisen lääkehoidon merkitystä. Tutkittujen geenien variaatio voidaan ottaa huomioon esimerkiksi joidenkin syöpälääkkeiden, veren hyytymistä ehkäisevien lääkkeiden ja protonipumpun estäjien annostelussa optimaalisen hoitovasteen saavuttamiseksi. Farmakogenetiikka osoittautui merkittäväksi tekijäksi myös oikeuslääketieteellisessä kuolinsyynselvityksessä. Geneettisen variaation vaikutus trisyklisen masennuslääkkeen amitriptyliinin metaboliaan havaittiin oikeuslääketieteellisessä näytemateriaalissa. Lisäksi kuolemaan johtaneen doksepiini-myrkytyksen yhtenä vaikuttavana tekijänä todettiin olleen geneettinen variaatio CYP2D6-entsyymissä.