Drug Analysis without Primary Reference Standards : Application of LC-TOFMS and LC-CLND to Biofluids and Seized Material

Drug Analysis without Primary Reference Standards: Application of LC-TOFMS and LC-CLND to Biofluids and Seized Material Primary reference standards for new drugs, metabolites, designer drugs or rare substances may not be obtainable within a reasonable period of time or their availability may also be hindered by extensive administrative requirements. Standards are usually costly and may have a limited shelf life. Finally, many compounds are not available commercially and sometimes not at all. A new approach within forensic and clinical drug analysis involves substance identification based on accurate mass measurement by liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry (LC-TOFMS) and quantification by LC coupled with chemiluminescence nitrogen detection (LC-CLND) possessing equimolar response to nitrogen. Formula-based identification relies on the fact that the accurate mass of an ion from a chemical compound corresponds to the elemental composition of that compound. Single-calibrant nitrogen based quantification is feasible with a nitrogen-specific detector since approximately 90% of drugs contain nitrogen. A method was developed for toxicological drug screening in 1 ml urine samples by LC-TOFMS. A large target database of exact monoisotopic masses was constructed, representing the elemental formulae of reference drugs and their metabolites. Identification was based on matching the sample component s measured parameters with those in the database, including accurate mass and retention time, if available. In addition, an algorithm for isotopic pattern match (SigmaFit) was applied. Differences in ion abundance in urine extracts did not affect the mass accuracy or the SigmaFit values. For routine screening practice, a mass tolerance of 10 ppm and a SigmaFit tolerance of 0.03 were established. Seized street drug samples were analysed instantly by LC-TOFMS and LC-CLND, using a dilute and shoot approach. In the quantitative analysis of amphetamine, heroin and cocaine findings, the mean relative difference between the results of LC-CLND and the reference methods was only 11%. In blood specimens, liquid-liquid extraction recoveries for basic lipophilic drugs were first established and the validity of the generic extraction recovery-corrected single-calibrant LC-CLND was then verified with proficiency test samples. The mean accuracy was 24% and 17% for plasma and whole blood samples, respectively, all results falling within the confidence range of the reference concentrations. Further, metabolic ratios for the opioid drug tramadol were determined in a pharmacogenetic study setting. Extraction recovery estimation, based on model compounds with similar physicochemical characteristics, produced clinically feasible results without reference standards.

Lääkeaineiden ja huumeiden analyysi ilman vertailuaineita veri- ja virtsanäytteistä sekä takavarikoidusta materiaalista Lääkeaineiden ja huumeiden analysointi perinteisten analyyttisen kemian menetelmien avulla perustuu vertailuaineiden käyttöön. Tunnistus suoritetaan vertaamalla tuntemattoman yhdisteen fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia, kuten massaspektriä, UV-spektriä tai kromatografista retentiota, tunnetuilla vertailuaineilla saatuihin vastaaviin ominaisuuksiin. Pitoisuusmääritystä varten laaditaan kalibrointikuvaaja vertailuaineen avulla ja pitoisuus näytteessä lasketaan tämän kuvaajan perusteella. Valitettavasti satojen tai tuhansien vertailuaineiden hankkiminen laboratoriokäyttöön on kallista ja toisinaan hyvin hankalaa. Tässä väitöskirjatutkimuksessa luotiin strategia lääkeaineiden ja huumeiden analysoimiseksi ilman vertailuaineita toksikologisista ja forensisista näytteistä. Yhdisteiden tunnistamiseen kehitettiin uudentyyppinen nestekromatografia-lentoaikamassaspektrometrinen menetelmä, jossa tunnistus perustui ensisijaisesti tarkkaan molekyylimassaan ja isotooppijakaumaan. Retentioaikaa käytettiin tunnistuksessa, mikäli vertailuaine oli saatavilla. Automatisoidulla menetelmällä pystyttiin nopeasti ja luotettavasti seulomaan virtsanäytteistä yli 600 toksikologisesti merkittävää lääkeainetta, huumetta ja niiden aineenvaihduntatuotetta. Kvantitatiivinen analyysi perustui nestekromatografian ja kemiluminesenssityppi-ilmaisimen käyttöön. Ilmaisin tuottaa vakiovasteen kutakin typpiatomia kohden, joten kalibrointi suoritettiin vain yhdellä vertailuaineella ja tutkittavien yhdisteiden pitoisuus määritettiin tämän avulla. Menetelmä on erityisen sopiva forensiseen analytiikkaan, koska noin 90 % lääkkeistä ja huumeista sisältää typpeä. Tutkimuksessa kehitettyjen menetelmien avulla analysoitiin takavarikoituja huumausaineseoksia ilman vertailuaineita ja tuloksia vertailtiin akkreditoiduilla menetelmillä saatuihin. Kvantitatiiviset tulokset menetelmien välillä poikkesivat ainoastaan 11%. Veri- ja virtsanäytteistä analysoitiin tärkeitä emäksisiä rasvaliukoisia lääkeaineita ilman vertailuaineita määrittämällä ensin yleinen uuttosaanto tämän ryhmän aineille. Pitoisuusmäärityksen tarkkuus oli 24 % plasma- ja 18 % kokoverinäytteille virheiden ollessa aina sertifioitujen vertailuarvojen luottamusvälin sisäpuolella. Menetelmää sovellettiin myös kipulääke tramadolin ja sen aineenvaihduntatuotteiden analysoimiseen plasmasta farmakogeneettisessä tutkimuksessa arvioimalla uuttosaanto malliaineiden avulla. Kvantitatiivisten tulosten todettiin olevan kliiniseen tarkoitukseen nähden riittävän tarkkoja.