LKB1 tumor suppression in Peutz-Jeghers Syndrome

Kasvainten, ajatellaan syntyvän yksittäisen solun perimän mutaatioista, jonka seurauksena tuon solun kasvu häiriintyy. Ruoansulatuskanavan polyyppien syntyä käytetään usein mallina siitä, miten nämä epiteelisoluun kerääntyvät mutaatiot aiheuttavat asteittain pahenevan kasvuhäiriön. Peutz–Jeghersin oireyhtymä (PJS) on perinnöllinen polypoosisyndrooma, jossa oireita aiheuttavat erityisesti maha-suolikanavan hamartomatoottiset polyypit. Noin puolella PJS potilaista havaitaan mutaatioita LKB1 kasvunrajoite geenissä. Hiirille joilta toinen Lkb1 alleeli on poistettu (Lkb1+/-) kehittyy PJS-tyypin maha-suolikanavan polyyppeja, joissa on epiteelin liikakasvun lisäksi merkittävä sileälihaskomponentti, aivan kuten PJS polyypeissa. Kuten myös muissa ruoansulatuskanavan polypooseissa, sekä PJS että hiirten polyypeissa Cyclo-oxygenaasi-2:n (COX-2) määrä on usein kohonnut. PJS-polyyppien kehittymisen molekulaarinen mekanismi on kuitenkin selvittämättä. Koska vain osa PJS potilaista kantaa LKB1 mutaatioita, mutaatiot jossakin toisessa lokuksessa saattaisivat selittää osan PJS tapauksista. Jotta PJS:n geneettinen tausta selviäisi, seulottiin kolmen LKB1:n kanssa interaktoivan proteiinin (BRG1, STRADα ja MO25α) geenit PJS potilaista joilla ei ole havaittu LKB1 mutaatioita. Yhdessäkään tutkituista geeneistä ei havaittu tautia aiheuttavia mutaatioita. Näiden kolmen geenin pois sulkeminen, ja uusien menetelmien ansiosta kasvanut havaittujen Lkb1 mutaatioden määrä viittaavat LKB1:n olevan useimpien PJS tapausten taustalla. COX-2:n estäjien käyttö on tehokkaasti vähentänyt polyyppien määrää familiaarisessa adenomatoottisessa polypoosissa. Tästä johtuen COX-2:n eston tehokkuutta tutkittiin PJS polypoosissa. PJS-tyypin polypoosin havaittin pienenevän merkittävästi Lkb1+/- hiirissä, joilta oli lisäksi poistettu toinen tai molemmat COX-2:n alleeleista. Lisäksi farmakologinen COX-2:n esto Celecoxib:lla vähensi polypoosia tehokkaasti. Näin ollen COX-2:n eston tehokkuutta tutkittiin seuraavaksi PJS potilaissa. Kuuden kuukauden Celecoxib hoidon jälkeen polypoosin havaittiin vähentyneen merkittävästi osalla potilaista (2/6). Nämä tulokset osoittavat COX-2:n roolin PJS-polyyppien kehityksessä, ja viittaavat COX-2:n eston vähentävän polypoosia. Kasvunrajoitegeenin klassisen määritelmän mukaan kasvaimen kehitys vaatii perinnöllisen mutaation lisäksi geenin toisenkin alleelin mutaation, mutta PJS-polyyppien häiriintyneestä epiteelistä ei kuitenkaan systemaattisesti löydy toista LKB1:n mutaatiota. Havainto johti tutkimukseen, jossa selvitettiin voisiko LKB1:n kasvun rajoitus välittyäkin epäsuorasti tukikudokseksi ajatelluista sileälihassoluista. Tätä tutkittiin kehittämällä poistogeeninen hiirimalli jossa Lkb1 on mutatoitunut vain sileälihassoluissa. Näille hiirille kehittyi polyyppeja, jotka ovat kaikin tavoin PJS-polyyppien kaltaisia. Lkb1:n menettäneiden solujen havaittiin tuottavan vähemmän transformoivaa kasvutekijä beetaa (TGFß), joka aiheutti solujen välisen viestinnän heikentymisen ja mahdollisesti viereisten epiteelisolujen liikakasvun. Vastaava häiriö havaittiin myös PJS-potilaiden polyypeissa, mikä viittaa siihen, että potilaillakin sileälihassolujen häiriö on polyyppien taustalla. Havainto suuntaa täten hoitokohteiden etsintää ja osoittaa että LKB1 toimii kasvunrajoittajana epätyypillisellä tavalla pitäen naapurisolujen kasvun kurissa.

Peutz-Jeghers syndrome (PJS) is a condition characterized by gastrointestinal polyposis and increased risk of cancer. At the onset of this study, mutations in the LKB1 serine/threonine kinase had been identified in approximately half of the studied PJS patients, indicating that LKB1 is a tumor suppressor underlying at least a subset of PJS cases. Mice with targeted heterozygous deletion of Lkb1 develop gastrointestinal polyps remarkably similar to PJS polyps corroborating the tumor suppressor function of LKB1/Lkb1. Most importantly, the polyps in Lkb1+/– mouse contain a notable stromal compartment with a core of smooth muscle cells that is the defining characteristic of a PJS polyp. In addition, the PJS and mouse polyps frequently exhibit elevated cyclooxygenase-2 (COX-2), a feature also noted in other gastrointestinal polyposis syndromes. Despite the aforementioned characterizations, the molecular mechanism driving PJS polyp development has not been identified. As only a subset of PJS patients have been reported to harbor LKB1 mutations, mutations in other loci might represent an alternative cause of PJS. To characterize the genetic background of PJS, mutation analysis of three genes encoding LKB1 interacting proteins, BRG1, STRADα, and MO25α, was performed in PJS patients without identified LKB1 mutations. No disease causing mutations were detected in these genes. The exclusion of the studied candidate genes with these criteria, and the concurrent increase in frequency of detected LKB1 mutations does not support involvement of other loci in PJS. As COX-2 inhibition has been effective in suppression of familial adenomatous polyposis, the elevation of COX-2 in PJS polyps suggested that COX-2 inhibition could decrease PJS polyposis. This was investigated by genetic and pharmacological interventions that targeted COX-2 in the Lkb1+/– mice. In comparison to PJS modeling Lkb1+/– mice, the polyp burden in the Lkb1+/– mice with either mono- or biallelic deletion of COX-2 was dramatically reduced. Furthermore, a selective COX-2 inhibitor celecoxib efficiently suppressed the tumor burden in Lkb1+/– mice. COX-2 inhibition reduced particularly the incidence of the large (>5mm) polyps whereas the number of smaller polyps was unaffected, suggesting that COX-2 expression is not required for polyp initiation but contributes significantly to tumor growth. These results prompted a pilot clinical trial with PJS patients receiving 200mg of celecoxib twice a day for 6 months. A subset of PJS patients (2/6) responded favorably to the celecoxib treatment, and a significant reduction in polyposis severity was also noted when the polyp grading data of all patients were combined. Together the data establish the polyposis promoting role of COX-2 in Peutz-Jeghers polyposis, and suggest that COX-2 inhibition is efficient in suppression of PJS polyposis. Polyp development is commonly thought to result from mutations in epithelial cells. However, the characteristic stroma of PJS polyps together with the suggestion that polyps can retain a functional copy of Lkb1 raised the possibility of non-epithelial origin of tumorigenesis in PJS. To investigate this possibility, murine Lkb1 was deleted tissue specifically in smooth muscle cells. Both monoallelic and biallelic deletions resulted in the development of gastrointestinal polyps indistinguishable from PJS polyps. Moreover, multiplicity of tumors in the smooth muscle specific biallelic deletion was only moderately (1.8-fold) higher than in the monoallelic deletion, demonstrating that Lkb1 LOH in stromal cells is not required for polyp development. The Lkb1 deficient mesenchymal cells produced less TGFß, and p-Smad2 staining was reduced in epithelial cells adjacent to Lkb1 deleted mesenchyme. These results identified impaired TGFß signaling from mesenchyme to epithelium as a possible mechanism for polyp development. Consistently, the epithelial proliferation in tumors coincided with the reduced p-Smad2 staining and with Lkb1 deficiency of the adjacent stroma. The TGFß signaling defect was importantly also noted in polyps from PJS patients, supporting the role of stroma as a major contributor to PJS polyposis by generation of a permissive microenvironment for epithelial expansion. The results of this thesis contribute to the notion that LKB1 is the only PJS gene substantiating the findings from the Lkb1 heterozygous mouse model of PJS. From the viewpoint of therapy development, the results provide proof of principle for the efficacy of COX-2 chemoprevention in PJS. Furthermore, the discovery of the stromal-derived mechanism of LKB1 tumor suppression forms a basis for the development of novel therapeutic interventions targeting mesenchymal signaling in PJS polyposis and possibly other cancers with loss of LKB1.