Role of Basement Membrane and Extracellular Matrix Proteins in the Adhesion and Spreading of Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

The repair of corneal wounds requires both epithelial cell adhesion and migration. Basement membrane (BM) and extracellular matrix (ECM) proteins function in these processes via integrin and non-integrin receptors. We have studied the adhesion, spreading and migration of immortalized human corneal epithelial (HCE) cells and their interactions with the laminins (Lms), fibronectins and tenascins produced. Human corneal BM expresses Lms-332 and -511, while Lm-111 was not found in these experiments. HCE cells produced both processed and unprocessed Lm-332, whereas neither Lm-111 nor Lm-511 was produced. Because HCE cells did not produce Lm-511, although it was present in corneal BM, we suggest that Lm-511 is produced by stromal keratocytes. The adhesion of HCE cells to Lms-111, -332 and -511 was studied first by determining the receptor composition of HCE cells and then by using quantitative cell adhesion assays. Immunofluorescence studies revealed the presence of integrin α2, α3, α6, β1 and β4 subunits. Among the non-integrin receptors, Lutheran (Lu) was found on adhering HCE cells. The cells adhered via integrin α3β1 to both purified human Lms-332 and -511 as well as to endogenous Lm-332. However, only integrin β1 subunit functioned in HCE cell adhesion to mouse Lm-111. The adhesion of HCE cells to Lm-511 was also mediated by Lu. Since Lm-511 did not induce Lu into focal adhesions in HCE cells, we suggest that Lm-511 serves as an ECM ligand enabling cell motility. HCE cells produced extradomain-A fibronectin, oncofetal fibronectin and tenascin-C (Tn-C), which are also found during corneal wound healing. Monoclonal antibodies (MAbs) against integrins α5β1 and αvβ6 as well as the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptide inhibited the adhesion of HCE cells to fibronectin. Although the cells did not adhere to Tn-C, they adhered to the fibronectin/Tn-C coat and were then more efficiently inhibited by the function-blocking MAbs and RGD peptide. During the early adhesion, HCE cells codeposited Lm-332 and the large subunit of tenascin-C (Tn-CL) beneath the cells via the Golgi apparatus and microtubules. Integrin β4 subunit, which is a hemidesmosomal component, did not mediate the early adhesion of HCE cells to Lm-332 or Lm-332/Tn-C. Based on these results, we suggest that the adhesion of HCE cells is initiated by Lm-332 and modulated by Tn-CL, as it has been reported to prevent the assembly of hemidesmosomes. Thereby, Tn-CL functions in the motility of HCE cells during wound healing. The different distribution of processed and unprocessed Lm-332 in adhering, spreading and migrating HCE cells suggests a distinct role for these isoforms. We conclude that the processed Lm-332 functions in cell adhesion, whereas the unprocessed Lm-332 participates in cell spreading and migration.

Terveeseen sarveiskalvoon kohdistuva taittovirhekirurgia sekä vammat ja sarveiskalvon sairaudet asettavat suuret vaatimukset haavan paranemisen hallinnalle. Sarveiskalvon uloin kerros muodostuu tyvikalvoon kiinnittyvistä epiteelisoluista. Tyvikalvot ovat soluväliaineen tihentymiä ja toimivat epiteelisolujen kiinnittymisessä, liikkeessä, kasvussa ja erilaistumisessa. Nämä prosessit ovat tärkeitä haavanparanemisessa ja vaativat epiteelisolujen ja soluväliaineen välistä viestintää reseptoreiden välityksellä. Väitöskirjatyössäni selvitimme ne tyvikalvo- ja soluväliaineproteiinit joita ihmisen sarveiskalvon kuolemattomaksi tehdyt epiteelisolut (HCE-solut) tuottavat. Tuotettujen proteiinien merkitys HCE-solujen kiinnittymisessä, leviämisessä ja liikkeessä oli keskeinen tutkimuskohde. Laminiinit, fibronektiinit ja tenaskiini-C ovat glykoproteiineja, joiden on osoitettu välittävän epiteelisolujen kiinnittymistä ja liikettä haavanparanemisen aikana. Aikaisemmat tutkimukset osoittavat että fibronektiini ja tenaskiini-C lisääntyvät sarveiskalvohaavoissa ja tenaskiini-C estää hemidesmosomien muodostumista. Väitöskirjatyössäni osoitimme että ihmisen sarveiskalvon tyvikalvossa on laminiini-332:ta ja -511:tä. Aikaisemmista havainnoista poiketen näissä tyvikalvoissa ei ollut laminiini-111:tä. Tutkimuksemme osoittivat että HCE-solut tuottivat kuitenkin vain laminiini-332:ta, joten ehdotamme että sarveiskalvon strooman keratosyytit tuottavat laminiini-511:tä. Immunopresipitaatio ja Western blotting-menetelmällä selvitimme että HCE solut tuottivat myös EDA-fibronektiinia, onkofetaalista fibronektiiniä ja tenaskiini-C:tä. Tässä tutkimuksessa selvitimme myös ne integriinit ja muut reseptorit, joiden välityksellä HCE solut kiinnittyvät tuottamiinsa proteiineihin. HCE solujen kiinnittyessä alustaan ne tuottivat alleen prosessoimatonta ja prosessoitua laminiini-332:ta sekä tenaskiini-C:tä. Kiinnittymiskokeissa havaitsimme että HCE solut eivät kiinnittyneet tenaskiini-C:hen. Tuloksemme osoittivat myös että integriini β4 alayksikkö, joka toimii vahvaa eopiteelisolujen ja tyvikalvojen välistä kiinnittymistä välittävänä hemidesmosomin osana, ei toiminut HCE solujen kiinnittymisessä laminiini-332:teen tai laminiin-332/tenaskiini-C:hen. Näiden tulosten perusteella ehdotamme että tenaskiini-C estää hemidesmosomien muodostumista ja välittää HCE-solujen liikettä. Kiinnittymis- ja haavakokeisiimme perustuen ehdotamme myös, että prosessoimaton laminiini-332 toimii HCE solujen leviämisessä ja liikkeessä ja prosessoitu laminiini-332 toimii solujen varhaisessa kiinnittymisessä.