Transcriptional regulation by the orphan nuclear receptor ERRgamma

The nuclear receptor (NR) superfamily is comprised of receptors for small lipopfilic ligands such as steroid hormones, thyroid hormone, retinoids, and vitamin D. NRs are ligand-inducible transcription factors capable of both activating and repressing their target gene expression. They control a wide range of biological functions connected to growth, development, and homeostasis. In addition to the ligand-regulated receptors, the family includes a large group of receptors whose physiological ligands are unknown. These receptors are referred to as orphan NRs. Estrogen-related receptor gamma (ERRgamma) belongs to the ERR subfamily of orphan NRs together with the related ERRalpha and ERRbeta. ERRs share amino acid sequence homology with the classical estrogen receptors (ERs) but they are unable to bind natural estrogenic ligands. ERRgamma is expressed in several embryonic and adult tissues but its biological role is still largely unknown. ERRgamma activates reporter gene expression in transfected cells independently of added hormones implying that ERRgamma harbors constitutive activity. However, the intrinsic activity of ERRgamma can be inhibited by synthetic compounds such as the selective estrogen receptor modulator 4-hydroxytamoxifen (4-OHT). Ligands of NRs can act as agonists that activate transcription, as antagonists that prevent activation of transcription, or as inverse agonists that antagonize the constitutive transcriptional activity of receptor. Most of the synthetic ERRgamma ligands act as inverse agonists but recently, a synthetic ERRgamma agonist GSK4716 was identified. This demonstrates that it is possible to design and identify agonists for ERRgamma. Prior to this thesis work, the structural and functional characteristics of ERRgamma were largely unknown. The aim of this study was to define the functional requirements for ERRgamma-mediated transcriptional regulation and to examine the cross-talk between ERRgamma and other NRs. Due to the fact that natural physiological ligands of ERRgamma are unknown, another aim of this study was to seek new natural compounds that may affect transcriptional activity of ERRgamma. Plant-derived phytoestrogens have previously been shown to act as ligands for ERs and ERRalpha, and therefore the effects of these compounds were also studied on ERRgamma-mediated transcriptional regulation. This work demonstrated that ERRgamma-mediated transcriptional regulation was dependent on DNA-binding, dimerization and activation function-2. Heterodimerization with ERRalpha inhibited the transcriptional activity of ERRgamma. In addition to 4-OHT, another anti-estrogen, 4-hydroxytoremifene (4-OHtor), was identified as an inverse agonist of ERRgamma. Interestingly, ERRgamma activated transcription in the presence of 4-OHT and 4-OHtor on activator protein-1 binding sites. ERRgamma was found to interact with another orphan NR Nurr1 by repressing the ability of Nurr1 to activate transcription of the osteopontin gene. Transcriptional activity of ERRgamma was shown to be stimulated by the phytoestrogen equol. Structural model analysis and mutational experiments indicated that equol was able to bind to the ligand binding domain of ERRgamma. The growth inhibitory effect of ERRgamma on prostate cancer cells was found to be enhanced by equol. In summary, this study demonstrates that despite the absence of an endogenous physiological ligand, the activity of ERRgamma can be modulated in other ways such as dimerization with related receptors or by cross-talk with other transcription factors as well as by binding some synthetic or natural compounds.

Tumareseptorit ovat transkriptiotekijöitä, jotka kontrolloivat useita elimistölle tärkeitä toimintoja kuten solujen kasvua, kehitystä ja ylläpitoa. Ne sitovat pieniä rasvaliukoisia ligandeja kuten steroidihormoneja, kilpirauhashormoneja, retinoideja ja D-vitamiinia. Ligandien indusoimina tumareseptorit joko aktivoivat tai repressoivat kohdegeeniensä ilmentymistä soluissa. Ligandeilla indusoituvien reseptorien lisäksi tumareseptorien suurperheeseen kuuluu ns. orpoja tumareseptoreja. Näiden reseptorien fysiologisia ligandeja ei tunneta. Estrogeenireseptorin kaltainen reseptori gamma (ERRgamma) on orpo tumareseptori. ERR-perheeseen kuuluvat myös ERRalfa ja ERRbeta. ERR-perheen reseptoreilla on samankaltainen aminohapposekvenssi kuin klassisilla estrogeenireseptoreilla, mutta ne eivät sido luonnollisia estrogeenisiä ligandeja. ERRgamma ilmentyy useissa sikiön ja aikuisen kudoksissa, mutta sen biologinen rooli on yhä suurelta osin tuntematon. Soluviljelmissä tehdyissä kokeissa ERRgamma aktivoi raportoijageenin ilmentymistä itsenäisesti ilman mitään lisättyä hormonia. Sen aktiivisuutta voidaan kuitenkin inhiboida joillakin synteettisillä yhdisteillä kuten selektiivisellä estrogeenireseptorimodulaattorilla, 4-hydroksitamoksifeenillä (4-OHT). Tumareseptorien ligandit voivat toimia joko agonisteina aktivoiden transkriptiota tai antagonisteina estäen transkription aktivoinnin. Näiden lisäksi jotkut ligandit toimivat ns. käänteisinä agonisteina inhiboiden reseptorin luonnollista aktivointikykyä. Suurin osa ERRgamman synteettisistä ligandeista toimii käänteisinä agonisteina, mutta hiljattain identifioitu ERRgamman ligandi GSK4716 toimii agonistina. Tämä osoittaa, että ERRgammalle on mahdollista suunnitella ja identifioida myös agonistisia ligandeja. Ennen tätä väitöskirjatyötä ERRgamman rakenteelliset ja toiminnalliset ominaisuudet olivat pääosin tuntemattomia. Tämän tutkimustyön tavoitteena oli määritellä toiminnalliset ominaisuudet, jotka tarvitaan ERRgamma-välitteiseen transkription säätelyyn. Tarkoituksena oli myös tutkia ERRgamman ja muiden tumareseptoreiden välistä vuorovaikutusta. Koska ERRgamman fysiologisia ligandeja ei tunneta, haluttiin etsiä uusia luonnollisia yhdisteitä, jotka voisivat vaikuttaa ERRgamman transaktivaatiokykyyn. Kasviestrogeenien on aikaisemmin todettu toimivan ligandeina estrogeenireseptoreille ja ERRalfalle ja siksi niiden vaikutuksia haluttiin tutkia myös ERRgamman välittämässä transkription säätelyssä. Tämä työ osoitti, että ERRgamman välittämä transkription säätely on riippuvaista reseptorin DNA-sidonnasta, dimerisoitumisesta ja aktivaatioalueesta 2. Heterodimerisoituminen ERRalfan kanssa inhiboi ERRgamman transkriptionaalista aktiivisuutta. 4-hydroksitoremifeenin (4-OHtor) huomattiin toimivan ERRgamman käänteisenä agonistina. 4-OHT ja 4-OHtor ovat rintasyövän hoidossa käytettyjä lääkkeitä. Näillä lääkkeillä on kudosriippuvaisesti elimistössä joko estrogeenisiä tai antiestrogeenisiä vaikutuksia. 4-OHT:n ja 4-OHtor:n vaikutukset saattavat välittyä elimistössä myös ERRgamman kautta. Työssä osoitettiin, että ERRgammalla on vuorovaikutusta toisen orvon tumareseptorin, Nurr1:n, kanssa. ERRgamma estää Nurr1-reseptoria aktivoimasta osteopontiinigeenin transkriptiota. Työssä myös näytettiin, että ERRgamman aktiivisuutta voidaan stimuloida equolilla, joka on pääasiassa soijassa esiintyvä kasviestrogeeni. Rakennemallinnuksella ja mutaatiokokeilla osoitettiin, että equol sitoutuu ERRgamman ligandinsidonta-alueelle. Equol vahvisti ERRgamman kykyä vähentää eturauhassyöpäsolujen kasvua. Tämän työn perusteella voidaan todeta, että ERRgamman aktiivisuutta voidaan säädellä mm. dimerisoitumisella ja vuorovaikutuksella muiden tumareseptoreiden tai transkriptiotekijöiden kanssa. Sen aktiivisuuteen voidaan vaikuttaa myös joillakin synteettisillä ja luonnossa esiintyvillä yhdisteillä.