Cholesterol Disturbances in Inherited Neurodegenerative Diseases : Studies on Npc1, Ppt1 and Ctsd deficient mice

The central nervous system (CNS) is the most cholesterol-rich organ in the body. Cholesterol is essential to CNS functions such as synaptogenesis and formation of myelin. Significant differences exist in cholesterol metabolism between the CNS and the peripheral organs. However, the regulation of cholesterol metabolism in the CNS is poorly understood compared to our knowledge of the regulation of cholesterol homeostasis in organs reached by cholesterol-carrying lipoprotein particles in the circulation. Defects in CNS cholesterol homeostasis have been linked to a variety of neurodegenerative diseases, including common diseases with complex pathogenetic mechanisms such as Alzheimer s disease. In spite of intense effort, the mechanisms which link disturbed cholesterol homeostasis to these diseases remain elusive. We used three inherited recessive neurodegenerative disorders as models in the studies included in this thesis: Niemann-Pick type C (NPC), infantile neuronal ceroid lipofuscinosis and cathepsin D deficiency. Of these three, NPC has previously been linked to disturbed intracellular cholesterol metabolism. Elucidating the mechanisms with which disturbances of cholesterol homeostasis link to neurodegeneration in recessive inherited disorders with known genetic lesions should shed light on how cholesterol is handled in the healthy CNS and help to understand how these and more complex diseases develop. In the first study we analyzed the synthesis of sterols and the assembly and secretion of lipoprotein particles in Npc1 deficient primary astrocytes. We found that both wild type and Npc1 deficient astrocytes retain significant amounts of desmosterol and other cholesterol precursor sterols as membrane constituents. No difference was observed in the synthesis of sterols and the secretion of newly synthesized sterols between Npc1 wild type, heterozygote or knockout astrocytes. We found that the incorporation of newly synthesized sterols into secreted lipoprotein particles was not inhibited by Npc1 mutation, and the lipoprotein particles were similar to those excreted by wild type astrocytes in shape and size. The bulk of cholesterol was found to be secreted independently of secreted NPC2. These observations demonstrate the ability of Npc1 deficient astrocytes to handle de novo sterols, and highlight the unique sterol composition in the developing brain. Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis is caused by the deficiency of a functional Ppt1 enzyme in the cells. In the second study, global gene expression studies of approximately 14000 mouse genes showed significant changes in the expression of 135 genes in Ppt1 deficient neurons compared to wild type. Several genes encoding for enzymes of the mevalonate pathway of cholesterol biosynthesis showed increased expression. As predicted by the expression data, sterol biosynthesis was found to be upregulated in the knockout neurons. These data link Ppt1 deficiency to disturbed cholesterol metabolism in CNS neurons. In the third study we investigated the effect of cathepsin D deficiency on the structure of myelin and lipid homeostasis in the brain. Our proteomics data, immunohistochemistry and western blotting data showed altered levels of the myelin protein components myelin basic protein, proteolipid protein and 2 , 3 -cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase in the brains of cathepsin D deficient mice. Electron microscopy revealed altered myelin structure in cathepsin D deficient brains. Additionally, plasmalogen-derived alkenyl chains and 20- and 24-carbon saturated and monounsaturated fatty acids typical for glycosphingolipids were found to be significantly reduced, but polyunsaturated species were significantly increased in the knockout brains, pointing to a decrease in white matter. The levels of ApoE and ABCA1 proteins linked to cholesterol efflux in the CNS were found to be altered in the brains of cathepsin D deficient mice, along with an accumulation of cholesteryl esters and a decrease in triglycerols. Together these data demonstrate altered myelin architecture in cathepsin D deficient mice and link cathepsin D deficiency to aberrant cholesterol metabolism and trafficking. Basic research into rare monogenic diseases sheds light on the underlying biological processes which are perturbed in these conditions and contributes to our understanding of the physiological function of healthy cells. Eventually, understanding gained from the study of disease models may contribute towards establishing treatment for these disorders and further our understanding of the pathogenesis of other, more complex and common diseases.

Keskushermosto, eli aivot ja selkäydin, sisältää suhteellisesti enemmän kolesterolia kuin mikään muu elin. Keskeiset keskushermoston toiminnot, kuten viestejä solusta toiseen välittävien synapsien ja hermosäikeitä eristävien myeliinituppien muodostuminen on riippuvaista kolesterolin saatavuudesta. Kolesteroliaineenvaihdunnan säätely keskushermostossa on erilaista kuin muissa elimissä, sillä veri-aivoeste estää verenkierron mukana kulkevien kolesterolia sisältävien lipoproteiinikappaleiden pääsyn keskushermostoon. Tästä syystä keskushermoston solut valmistavat tarvitsemansa kolesterolin itse. Mikäli kolesterolin muodostuminen keskushermostossa on estynyt, on seurauksena vakavia kehityshäiriöitä. Tässä väitöskirjassa on tutkittu kolmea väistyvästi periytyvän neurologisen sairauden poistogeenista hiirimallia. Sairaudet, joiden malleja on käytetty, ovat Niemann-Pick tyyppi C-tauti (NPC), infantiili neuronaalinen seroidi lipofuskinoosi (INCL) ja cathepsin D-entsyymin puutos. Näistä NPC on aikaisemmin liitetty kolesteroliaineenvaihdunnan häiriöhin, sillä se johtaa massiiviseen kolesterolin kertymään soluissa. Ensimmäisessä osatyössä tutkittiin kolesterolin ja sen esiasteiden sekä lipoproteiinikappaleiden muodostumista ja erittymistä Npc1-geenipuutteisissa keskushermoston tukisoluissa, astrosyyteissä. Sekä terveet että poistogeeniset solut pystyvät muodostamaan kolesterolia. Sekä terveiden että poistogeenisten astrosyyttien solukalvoista löydettiin kolesterolin lisäksi suhteellisesti suuria määriä kolesterolin esiastetta desmosterolia. Desmosterolia on useimmissa solutyypeissä hyvin vähän. Lipoproteiinikappaleiden muodostuminen ja sterolien eritys ei ollut estynyt poistogeenisissä soluissa. Nämä havainnot osoittavat, että Npc1-puutteiset astrosyytit pystyvät muodostamaan ja erittämään steroleja. INCL aiheutuu Ppt1-entsyymin toiminnan puutoksesta soluissa. Toisessa osatyössä tutkittiin 14000 geenin ilmentymistä terveissä ja Ppt1-puutteisissa hiiren hermosoluissa. Useiden kolesterolin muodostumiseen osallistuvia entsyymejä koodittavien geenien ilmentyminen oli lisääntynyt Ppt1-puutteisissa soluissa ja vastaavasti kolesterolin muodostumien poistogeenisissä soluissa oli koholla verrattuna terveisiin soluihin. Nämä löydökset liittävät Ppt1-puutoksen kolesteroliaineenvaihdunnan häiriöön keskushermoston hermosoluissa. Kolmannessa osatyössä tutkittiin cathepsin D-entsyymin puutoksen vaikutusta myeliinin rakenteeseen ja rasva-aineenvaihduntaan aivoissa. Keskeisten myeliinin rakenneproteiinien määrät olivat muuttuneet cathepsin D-puutteisissa aivoissa ja myeliinin rakenne oli poikkeava. Poistogeenisissä aivoissa todettiin poikkeavat määrät myeliinille tyypillisiä rasva-aineita ja monityydyttymättömiä rasvahappoja viitaten valkean aineen eli myelinisoidun aivokudoksen tuhoon. Kolesterolin eritykseen liittyvien proteiinien määrät olivat muuttuneet poistogeenisissä aivoissa, joissa myös todettiin viisi kertaa enemmän kolesterolin varastomuotoa kolesteroliestereitä ja varastorasvojen, triglyseridien, määrän lasku verrattuna terveeseen kudokseen. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että cathepsin D-puutteisilla hiirillä on poikkeava myeliinin rakenne ja muutoksia aivojen kolesteroliaineenvaihdunnassa. Keskushermoston kolesteroliaineenvaihdunnan häiriöiden on arveltu myötävaikuttavan myös useiden keskushermostoa rappeuttavien sairauksien syntyyn. Näihin kuuluu yleisiä mutta tautimekanismiltaan monimutkaisia sairauksia, esimerkiksi Alzheimerin tauti. Aihetta on tutkittu runsaasti, mutta on edelleen epäselvää, millä mekanismeilla kolesteroliaineenvaihdunnan häiriöt vaikuttavat näiden sairauksien syntyyn ja etenemiseen. Kolesteroliaineenvaihdunnan ja keskushermoston rappeutumisen välistä yhteyttä voidaan valottaa käyttämällä tautimalleja, joissa on jonkin tunnetun yksittäisen geenin puutos. Näiden mallien avulla voidaan selvittää kolesteroliaineenvaihdunnan säätelyä terveessä keskushermostossa ja lisätä ymmärrystä niiden sairauksien kehittymisestä, joiden tautimekanismi on monimutkaisempi.